椎间盘退变对髓核干细胞功能影响及相关microRNA的表观遗传学调控机制研究

Intervertebral disc degeneration(IVDD) is the pathological basis of spinal degenerative diseases, however, the pathogenic mechanisms are still complex and unclear. Recently, the study of nucleus pulposus-derived stem cells(NPSCs) has provided a new sight for researching IVDD. Our previous study revealed that the proliferation of NPSCs and expression of gene markers decreased due to IVDD. Moreover, the decreased proliferation of stem cells in other degenerative tissues has also been noted. Therefore, the decreased function of NPSCs may accelerate IVDD. Up-regulation of NPSCs’ function seems to be a novel strategy to break the vicious circle of IVDD. Nonetheless, how the function of NPSCs changes with IVDD and related mechanisms have not been documented. Therefore, this study aims to test the function of NPSCs from different levels of degenerative discs and to study the microRNA mediated epigenetic regulation mechanism of related cell signaling pathways. This research will provide important scientific evidences on target-regulation of NPSCs’ function for further IVDD repair.

椎间盘退变是脊柱退行性疾病的病因学基础，但其机制并不明确。近年来，髓核干细胞的发现为椎间盘退变的研究提供了新的方向。我们前期研究发现退变椎间盘中获取的髓核干细胞增殖能力和干性基因的表达下降，检索文献发现其他退变组织中的干细胞也存在类似现象。因此，有理由认为椎间盘退变导致髓核干细胞功能下降是进一步加剧椎间盘退变的重要原因。通过调控髓核干细胞的功能来阻断这一恶性循环，将可能成为治疗椎间盘退变的新方法。然而，不同程度椎间盘退变对髓核干细胞功能影响的差异尚不明确，导致髓核干细胞功能下降的相关机制也未见报道。因此，本课题拟从不同退变程度的椎间盘中分离、鉴定髓核干细胞，检测其功能状态差异，并探索相关miRNA的表观遗传学调控机制，为后续通过靶向调控髓核干细胞功能来治疗椎间盘退变的研究奠定基础。

椎间盘退变的机制研究一直是热点，近年髓核干细胞（Nucleus pulposus-derived stem cells，NPSCs）的发现为椎间盘退变研究提供了新方向。文献记载人体其他退变组织中干细胞存的功能呈现下降状态，表现为增殖能力减弱及干性基因表达下调。因此，退变椎间盘组织中髓核干细胞功能下降可能是进一步加剧椎间盘退变的重要原因。本项目分两部分进行，第一部分探讨了不同退变程度椎间盘NPSCs的功能变化，将手术获取的髓核组织分为轻微退变组（Pfirrmann I & II级，Mild Degeneration，MD）和严重退变组（Pfirrmann III，IV & V级，Serious Degeneration，SD），观察其形态，并对各组NPSCs进行分离、诱导及干性基因鉴定，检测其增殖能力。结果提示退变椎间盘组织中存在高分化类圆形NPSCs，分离后可经成骨、成软骨和成脂三系诱导分化，干性基因CD73、 CD90、 CD105、HLA-ABC表达阳性，其中MD组表达显著强于SD组。同时，MD组在CCK-8检测中，从培养第五天起OD值显著高于SD组，克隆集落形成也强于SD组。这些结果表明随着椎间盘髓核组织退变的加重，髓核干细胞功能下降显著。第二部分探讨了椎间盘退变导致NPSCs功能改变的可能机制，包括使用pHeatmap软件筛选两组差异性表达基因并进聚类分析；采用ggplot2，String，Limma和Cytoscape软件筛选明显表达差异的上调和下调mRNA；对差异表达基因进行GO分析；基于 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）数据库，对差异基因行Pathway显著性分析；使用MiRWalk 2.0、TargetScan 7.0和microRNA.org三个数据库对其上游的miRNA进行预测。结果提示：WNT 3A基因在SD组的表达明显高于MD组，通过在线预测工具的预测，我们发现miR-216a-3p为WNT3A基因潜在的上游调节机制，通过PCR检测验证发现SD组miR-216a-3p的表达量明显低于MD组，由此，我们认为随着椎间盘退变程度的加重miR-216a-3p的含量逐渐降低，进而导致其下游WNT 3A基因的表达量增加，从而造成椎间盘退变的进一步加重，该发现为后续针对椎间盘退变的靶向治疗提供了可能。