胚胎干细胞外泌体逆转退变椎间盘髓核干细胞再生能力的机制研究

Restoring regenerative potential of degenerative nucleus pulposus stem cells (NPSCs) is a critical target in the treatment of intervertebral disc degeneration. It is believed that exosomes secreted by stem cells are dominant force in tissue repair of implanted cells. Exosomes are one of the secreted vesicles that contain proteins, messenger RNAs (mRNAs), and miRNAs. Embryonic stem cells with their unique miRNA and protein content as well as signature cell cycle activity represent an attractive source of exosomes for augmentation of degenerative NPSC proliferative and survival/differentiation. The previous study demonstrates human embryonic stem cell conditioned medium are able to upregulate NPSCs stem markers and promote proliferation of NPSCs. The present work is undertaken to explore the hypothesis that the exosomes derived from ESC (ESC-ex) would restore or upregulate the proliferative capability of degenerative NPSCs. We will focus on identifying the signaling pathway, especially the molecular mechanism of miRNAs and confirm the specific bioactive molecules contained in ESC-ex, which will provide.fundamental information for development of the novel treatment for intervertebral disc degeneration based on ESC-ex.

研究显示逆转退变髓核干细胞再生能力是治疗椎间盘退变性疾病的关键。干细胞分泌的外泌体是植入干细胞发挥修复作用的主导物质。胚胎干细胞分泌的外泌体含有与其无限增殖能力相关的独特miRNAs、蛋白质和特有细胞周期活性。我们前期实验发现胚胎干细胞条件培养液及其外泌体可显著提高退变髓核干细胞增殖活性并上调干细胞特异表面抗原的表达。但其具体的分子机制及临床应用潜力尚不明确。本项目在此基础上提出科学假说：胚胎干细胞外泌体是增强退变髓核干细胞再生活性的主导物质，其含有的miRNAs等活性物质能激活退变髓核干细胞再生能力。我们拟探讨胚胎干细胞外泌体对退变髓核干细胞再生活性的影响及其机制；重点研究外泌体包含的miRNAs对靶细胞的作用机制，明晰具体miRNAs与细胞行为之间的相关性，为探索开发既能利用胚胎干细胞强大增殖能力，又避开免疫排斥和成瘤问题的“非细胞形式”外泌体治疗椎间盘退变性疾病的新模式提供科学依据。

本项目通过提取人ESCs条件培养液中的外泌体，初步鉴定其特定mRNAs和miRNAs组成。通过ESC-ex体外作用退变椎间盘来源的NPSCs，研究ESC-ex独特的mRNAs、miRNAs和特有的细胞周期活性对人退变椎间盘NPSCs增殖能力、分化潜能及对其衍生物髓核细胞增殖能力、基质分泌能力等细胞行为的影响；揭示ESC-ex影响可促进退变NPSCs发生去分化，诱导退变髓核细胞去分化重新获得干细胞功能，增殖能力随之增强，凋亡减少，并伴随着基质分泌功能显著增强。ESC-ex能够明显促进脊索细胞标志基因Brachyury、SHH、FoxA1及髓核相关基因KRT19、HIF-1α、GLUT-1、FoxF1转录水平的表达及显著抑制髓核相关基因CD24、COL1A2的表达。胚胎干细胞来源外泌体预处理后，髓核细胞在3D Pellet诱导分化体系下具有更强的细胞外基质分泌能力，且硫酸化糖胺聚糖与羟脯氨酸的比值明显上调；而在组织培养-裸鼠肾膜下移植体系下，经外泌体处理后的组织驻留髓核细胞能够显著改善退变组织的细胞外基质成分比例，使其拥有更多亲水性的Aggrecan，且观察到强烈表达脊索标志Brachyury的脊索细胞的出现。.ESCs-exo可有效缓解退变椎间盘NPCs的衰老进程，其作用机制可能是通过向NPCs递送ESCs-exo源的miR-302c-3p，靶向Hippo通路核心激酶LATS2，从而促进其下游效应子YAP入核； YAP下游信号的激活，不仅促进细胞增殖，同时抑制衰老相关因子的表达，从而缓解退变椎间盘髓核细胞的衰老进程。通过干预miRNAs表达，明晰具体miRNA与细胞行为之间的相关性及其临床应用潜力，为椎间盘退变的生物治疗提供科学依据。