哈氏噬纤维菌新型蛋白分泌系统PorSS的组成以及效应蛋白的鉴定和穿膜识别序列研究

Protein secretion system is closely related to bacterial physiological processes. The study of the protein secretion system of Gram-negative bacteria was mainly focused on phylum Proteobacteria while phylum Bacteroidetes was lack of study. Recently, a novel protein secretion system named the Por secretion system (PorSS) has been found in Porphyromonas gingivalis which belongs to phylum Bacteroidetes. 12 proteins was identified in PorSS but transport mechanism of the system is still unkonwn. Cytophaga hutchinsonii is a cellulolytic gliding bacterium in phylum Bacteroidetes. Its unique cellulose degradation mechanism and gliding mechanism required the participation of a variety of cell surface proteins. Genome sequence analysis and our preliminary experiments proved that it also has similar PorSS system. This project intends to knockout the predicted PorSS genes in order to identify the major component of the PorSS of C. hutchinsonii. The basic structure of the PorSS will be determined by the study of the protein secretion property of the knockout mutant, subcellular localization of the major components and formation of protein polymers. The effector proteins secreted by the SSpor of C. hutchinsonii will be identified by comparing the proteomes of the secretoty proteins of knockout mutant and the wild type strain. The recognition sequence of the secretory proteins of SSpor C. hutchinsonii will be determined by gradual knocking out of the two ends of the protein sequence and the subcellular localization of the mutant protein, especially recognition sequence of the secretory proteins without signal peptide.

蛋白分泌系统与细菌许多重要生理过程密切相关。革兰氏阴性细菌的蛋白分泌主要围绕变形杆菌门进行，而拟杆菌门则缺乏研究。最近，在拟杆菌门的牙龈卟啉单胞菌中发现一类新型蛋白分泌系统 (PorSS)，已发现有12个蛋白参与该系统但其蛋白转运机理尚不清楚。哈氏噬纤维菌是拟杆菌门中一种具有极强的纤维素降解能力的滑动细菌。其独特的纤维素降解和滑动机制都需要多种细胞表面蛋白的参与。我们通过序列比对和初步实验证明哈氏噬纤维菌具有类似PorSS的蛋白运输系统。本课题拟对序列比对获得的PorSS相似基因逐一进行基因敲除，以确定SSpor系统的主要组分。并根据突变株蛋白分泌情况和主要组分的亚细胞定位以及聚合体形成，初步确定SSpor的基本结构。通过突变株和野生株的差异分泌蛋白谱，确定SSpor的主要效应蛋白。通过对效应蛋白的逐段敲除突变和亚细胞定位，确定效应蛋白的穿膜识别序列，尤其是无信号肽效应蛋白的穿膜识别序列。

最近在拟杆菌门中发现一类新型的跨外膜转运系统PorSS。哈氏噬纤维菌是拟杆菌门中一种具有极强的纤维素降解能力的滑动细菌。通过序列比对发现哈氏噬纤维菌有11个与PorSS系统的同源基因，我们通过实验室开发的线性DNA双交换和FLP-FRT无标记敲除方法，对C. hutchinsonii这些T9SS相关基因进行了敲除，获得9个PorSS同源基因缺陷株，分别对各个突变株表型进行研究，发现其中的PorU、PorP、SprA、PorN和SprT五个基因对哈氏噬纤维菌蛋白的分泌、纤维素降解、菌体滑动和均有显著影响，认为是PorSS运输系统的主要组分。说明哈氏噬纤维菌PorSS系统与纤维素降解和菌体滑动密切相关。其中的PorU可能起到信号肽酶的作用，对分泌蛋白的分泌后切割成熟其关键作用。而SprA、PorN和SprT则可能是转运系统的主要结构蛋白，与分泌蛋白的转运密切相关。另外，我们还发现PorKLM这组基因无论用什么方法均无法获得敲除突变株，推测他们可能是哈氏噬纤维菌的必需基因，可能参与某些必需营养物质的吸收。而在其他具有PorSS的拟杆菌中，PorSS的组分均不影响菌体的生长繁殖，这说明在哈氏噬纤维菌PorSS的功能更为广泛和重要。我们通过抗体制备和western blot 对各主要组分的蛋白进行了细胞定位，确定其主要存在于细胞外膜。通过突变株和野生株的差异蛋白谱分析，我们鉴定出多个PorSS运输系统主要的效应蛋白。进而通过对效应蛋白的逐段敲除突变和亚细胞定位分析，初步揭示PorSS运输系统对效应蛋白的识别是通过效应蛋白的C端CTD序列，蛋白成熟后CTD序列被切割掉。我们还发现部分分泌蛋白的信号肽与细菌的信号肽明显不同，而与真菌的信号肽有一定的相似性。这些工作为揭示哈氏噬纤维菌的新型的跨外膜分泌系统对蛋白的分泌机制具有重要的意义。