CHU_3237介导的纤维素酶在哈氏噬纤维菌表面锚定机制

Development and utilization of renewable biomass as an alternative energy sourse has important practical significance and broad prospects. Cytophaga hutchinsonii, a Gram-negative Bacteroidetes bacterium, uses a novel unknown strategy to degrade cellulose completely and efficiently without free cellulases and multienzyme complexs like cellulosomes. Recently we found that several cellulases were anchored on the cell surface of C. hutchinsonii. However, these cellulases do not contain a hydrophobic transmembrane domain or any anchoring domain. Based on our previous study, we speculated that the anchoring system might be coupled with the protein transportation system T9SS. And CHU_3237 might play an important role in this process. It mediated ont only the recognation and cutting of the CTD domain of celulases, but also the anching of cellulases on the cell surface. This is a novel anchoring form of cell-surface protein for Gram-negative bacterium. In this project, the role of CHU_3237 in protein anchoring will be determined by structural analysis and functional study. The reporting system of proteins anchoing on the cell surface of C. hutchinsonii will be constructed in order to study the recognition sites and the recognition mechanism of CHU_3237. And the main influencing factors of anchoring efficiency will be explored. This study attempts to reveal the novel anchoring mechanism of cellulases on the cell surface of C. hutchinsonii, which would be helpful to reveal its cellulose degradation strategy and to construct new bioconversion system of cellulose.

开发利用生物质资源为替代能源具有重要的现实意义和广阔的发展前景。革兰氏阴性拟杆菌哈氏噬纤维菌既不分泌游离的纤维素酶，也没有类似纤维小体的多酶复合物结构，而是利用一种新型未知的策略迅速降解纤维素。最近我们发现该菌具有细胞表面锚定的纤维素酶系，但这些纤维素酶即没有疏水的跨外膜结构域，也没有其它锚定结构域。基于前期工作，我们推测纤维素酶的锚定与T9SS蛋白分泌系统相偶联，其中CHU_3237起着关键作用，它介导了对纤维素酶CTD结构域的识别切割以及在细胞表面的锚定。这是革兰氏阴性细菌一种新型的表面蛋白锚定方式。本课题拟通过结构分析和功能研究确定CHU_3237在锚定中的作用，通过构建表面蛋白锚定报告系统深入研究CHU_3237对效应蛋白的识别和锚定机制，探索影响锚定效率的关键因素，初步阐明哈氏噬纤维菌表面纤维素酶的新型锚定机制，为揭示其高效纤维素降解机制和构建新型纤维素生物转化体系提供帮助。

Cytophaga hutchinsonii是广泛存在于土壤中的拟杆菌门革兰氏阴性细菌，具有较强的纤维素降解能力。与厌氧梭菌和真菌降解纤维素不同，C. hutchinsonii不形成纤维小体结构，亦不分泌游离的纤维素酶，是通过细胞表面纤维素酶参与的新型纤维素降解机制快速高效地降解结晶纤维素。T9SS是近年发现的仅存在于拟杆菌门的新型蛋白分泌系统。T9SS的效应蛋白具有保守的C端结构域 (CTD)，T9SS通过识别底物蛋白的CTD序列将底物蛋白转运出细胞外膜。推测T9SS参与表面纤维素的分泌和锚定。C. hutchinsonii基因组中含有T9SS的一系列编码基因，但各组分的功能尚不清楚。CHU_3237是T9SS中切割底物蛋白CTD的肽酶。我们通过定点突变鉴定了CHU_3237的肽酶活性位点，发现His803与 Cys837突变后会影响C. hutchinsonii滤纸降解和菌体扩散能力，同时也造成了部分表面蛋白和胞外蛋白显著缺失。我们的研究表明CHU_3237通过影响纤维素酶等表面蛋白的分泌和锚定进而影响菌体的纤维素降解和运动功能。我们发现CHU_3238也是T9SS的重要组分蛋白，其缺失会影响纤维素酶等表面蛋白的分泌，而且还影响了细胞外膜的完整性。此外，还发现纤维素酶在细胞表面锚定与LPS的完整性相关。我们初步尝试在大肠杆菌对CHU_3237进行异源表达，但是发现表达产物存在明显降解的现象。我们成功构建了表面蛋白锚定的报告系统，确定了CHU_3237切割T9SS底物蛋白CTD的位点，并意外发现C. hutchinsonii 的CTD存在N-糖基化修饰，且糖基化修饰影响 T9SS 底物的运输和定位。进一步研究发现CHU_3237功能缺失会影响CTD的糖基化。这是首次在拟杆菌门细菌发现的N-糖基化修饰现象。T9SS底物蛋白CTD的糖基化修饰与T9SS对底物蛋白的识别是否相关？值得进一步探讨研究。此外，我们还发现C. hutchinsonii T9SS参与钙离子和镁离子的跨外膜转运的新功能，并基于此通过改进突变株的筛选条件首次获得T9SS重要组分GldN、SprA，SprT及PorV编码基因的敲除株，并对其在纤维素降解和菌体滑动方面的功能进行了研究。我们的研究为揭示C. hutchinsonii独特的纤维素降解机制提供重要依据，也为其他拟杆菌T9SS的功能研究提供了新