哈氏噬纤维素菌独特纤维素酶的研究

好氧噬纤维菌具有极强的结晶纤维素降解能力。与已经阐明的其它微生物纤维素降解模式不同，噬纤维菌具有独特的纤维素水解代谢机制，但目前这方面的研究几乎是个空白。本项目拟以全基因组序列已测定完成的高效结晶纤维素降解菌株Cytophaga hutchinsonii为实验材料，对噬纤维菌的独特纤维素酶系，尤其是膜相关纤维素酶组分进行分离鉴定，通过对底物的吸附与降解进行功能表征；通过波谱学、分子动力学和计算机模拟分析推测酶的结构与功能，通过构象和结构域的拆分与组合分析其结构与功能；在建立该菌遗传操作体系的基础上，深入阐述噬纤维菌独特的纤维素降解机制，为进一步通过比较分析微生物不同的纤维素降解模式，建立发展纤维素转化利用的新策略提供理论基础，填补细胞结合型非复合体纤维素降机制研究的空白，丰富和发展纤维素降解的理论体系。

噬纤维素菌具有独特的纤维素降解机制。本项目在实施过程中以哈氏噬纤维素菌（Cytophaga hutchinsonii）为对象开展了相关研究，取得了系列成果。（1）通过对细胞不同部位酶活性分析，表明哈氏噬纤维素菌的纤维素酶组分定位于其细胞的外膜上，纤维二糖或纤维寡糖的降解主要发生在其细胞质膜上；（2）从哈氏噬纤维素菌外膜上分离纯化到CHU_1107、CHU_1075和CHU_3384三种纤维素酶组分，CHU_1107的催化结构域和CHU_1280在大肠杆菌中获得活性表达；（3）对分离纯化的和克隆表达的酶组分进行了酶学性质表征，显示这些纤维素酶组分的底物专一性和产物谱有差异，表明不同酶组分对纤维素底物有不同的作用方式；（4）将瑞氏木霉CBHⅠ的CBM及Linker区通过基因融合PCR的方式与CHU_1107GH5的C端融合在一起，并在大肠杆菌中获得表达，该杂合重组酶降解结晶纤维素的能力得到提高；（5）利用转座质粒pHimarEm1和基于基因组复制原点序列的复制型质粒pLYL03C，优化和确定了菌体培养及电转化的最佳条件，从而构建完善了哈氏噬纤维素菌的遗传操作体系；（6）通过对不同碳源条件下的定量PCR检测分析、胞内不同部位蛋白质组分的SDS-PAGE分析以及转录组分析，表明不同的纤维素酶组分和-葡萄糖苷酶组分受纤维素底物的诱导表达情况不同，其中纤维素酶CHU_1655的表达量最高；（7）选取了该菌中有代表性的四个纤维素酶基因（chu_1655、chu_1107、chu_1280和chu_1335）进行了单基因插入失活，结果显示尽管引起生长延迟，但任何单一纤维素酶基因的失活突变会被其它纤维素酶基因的表达所弥补；（8）通过插入失活突变，筛选获得了一批纤维素利用缺陷型突变株，并通过质粒拯救确定了突变的基因位点，对有代表性的CHU_1719和CHU_2981两个未知功能的外膜蛋白的作用与功能进行了分析，显示两者可能参与细胞外膜蛋白的定位或组装；（9）对与解淀粉拟杆菌中SUS（starch utilization system，淀粉利用系统）类似的chu_1276～1279基因簇的作用与功能进行了分析，初步结果显示该基因簇编码的蛋白组分可能参与外膜上纤维素降解结构的形成。以上结果初步揭示了哈氏噬纤维素菌的纤维素降解机制，这对后续该菌纤维素降解作用的深入研究奠定了理论和技术基础。