水稻籽粒大小调控因子RGS1的分离及功能研究

Grain size is one of the most important factors determining rice yield production. However, the molecular mechanisms underlying grain size are still poorly known. The aim of this project is to further elucidate the fine regulation mechanism of rice grain size. We previously identified a reduced grain size mutant, rgs1, by EMS mutagenesis, and the RGS1 gene had been cloned by a positional cloning strategy. Sequence analysis revealed that RGS1 encodes the fatty acid synthetase. Functional analysis of RGS1 gene will be conducted following. The target gene will be verified by functional complementation experiments. The expression pattern of RGS1 will be determined by qRT-PCR, northern blot, as well as confocal laser microscopy-based assay using a RGS1 promoter-driven GUS transgene. Furthermore, RNA-seq, yeast two-hybrid technologies and bioinformatics analysis will also be employed to screen the downstream candidate genes and RGS1 interacting proteins. Finally, in order to reveal the physiological basis of RGS1 gene, the different components of polar lipids in vegetative tissues and storage lipids in mature seeds between wide type and rgs1 mutant will be explored. The cloning and characterization of RGS1 in this project will enhance not only our understanding of the molecular basis of grain size, but should also facilitate the development of high yielding rice varieties.

籽粒大小是水稻产量形成最重要的决定因素之一，然而调控水稻籽粒大小的分子机理还不清楚。利用EMS诱变我们分离到一个水稻籽粒变小突变体rgs1，通过图位克隆我们已获得RGS1候选基因，该基因编码一个脂肪酸合成相关的蛋白酶。本研究拟在此基础上开展后续研究，首先通过功能互补实验验证RGS1功能，进而通过qRT-PCR、Northern杂交及激光共聚焦等技术研究该基因的时空表达模式。而后，采用RNA-seq技术、酵母双杂技术和生物信息学方法筛选RGS1的下游调控因子及与RGS1互作的蛋白；通过分析野生型和突变体植株叶片及籽粒中脂肪酸组分差异探讨脂肪酸生物合成与水稻植株发育及籽粒大小之间的关系，最终阐明RGS1基因在水稻籽粒大小调控中的作用机制。项目研究结果不仅对揭示水稻籽粒大小分子机理有重要价值，还将为我国水稻高产育种发展贡献力量。

为分离更多参与水稻粒形调控的关键基因，我们通过对EMS诱变获得水稻突变体库进行筛选，发现了若干粒形差异的突变体，其中一个突变体rgs1表现为籽粒变小的表型，通过图位克隆我们获得RGS1候选基因，该基因编码一个脂肪酸合成相关的酶。本研究在此基础上对RGS1基因功能进行验证，同时探讨RGS1调控水稻籽粒大小的作用机制。结果如下：1）通过构建RGS1转基因互补载体并利用农杆菌介导转化rgs1突变体，获得的转基因阳性植株在株高、籽粒大小、千粒重等表型均恢复到野生型水平，证明RGS1基因的准确性。2）细胞学观察显示，rgs1突变体叶鞘表皮细胞明显小于野生型，且部分细胞周期相关调控基因在突变体中表达量变化显著，说明RGS1可能通过影响细胞分裂和生长来调控水稻籽粒大小。3）亚细胞定位结果显示RGS1是一个类囊体膜定位的蛋白，通过体外诱导蛋白酶活检测，RGS1确实具有脂肪酸合成酶的活性。4）qRT-PCR和GUS组织染色分析表明，RGS1基因在叶鞘和叶片中表达最高、其次为根系及幼穗的颖壳，而在茎秆、花药中几乎没有表达。5）气相色谱分析显示，RGS1基因突变导致突变体叶片C18:3含量显著下降，而成熟籽粒中除C18:1稍有上升外其他脂肪酸组分无显著变化，说明RGS1确实参与了水稻脂肪酸的生物合成。6）转录组分析显示，共有483个基因表达量在野生型和rgs1突变体中存在显著差异（P≤0.05），其中有40%的差异基因与质膜和氧化还原平衡相关，暗示RGS1可能参与了质膜的发育调控和细胞内氧化还原平衡维持。7）我们还发现RGS1参与了水稻耐热性的调控，RGS1突变引起45℃热处理下突变体叶片中ROS过量积累和细胞死亡，最终导致植株枯萎死亡。总之，通过本项目的实施，我们克隆获得了一个新的水稻粒形调控基因RGS1，明确了RGS1基因的亚细胞定位、表达模式和生物学功能，相关研究结果有助于进一步理解水稻粒形调控的分子机理，并为后续水稻高产分子育种提供具有应用价值的新基因。