基于Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用的黄酮类化合物间接抗氧化的定量构效关系及分子机制研究

Flavonoids which are ubiquitously distributed in fruits and vegetables, are a significant source of natural antioxidants with diverse biological activity. Flavonoids' antioxidant properties as a free radicals scavenger has been recognized as the basis of its biological activities. The classical "hydrogen-donating" theory can demonstrate the chemical mechanism of flavonoids' interaction with free radicals, however, is not sufficient to explain the intracellular antioxidant activity in consideration of its low bioavailability. Keap1-Nrf2-ARE (Kelch-like ECH associated protein 1-nuclear factor erythroid 2-related factor 2-antioxidant response element) signaling pathway has been proven to be the most effective means for flavonoids to exert indirect antioxidant activities. In this project, the structure-indirect antioxidant activity relationship of flavonoids will be illustrate according to the Quantitative Atructure-Activity Relationship model by using the Dual-Luciferase reporter assay system. The interaction between flavonoids and Keap1-Nrf2 complex will be investigated by using experiment methods used to analysis the interaction between small molecules and bio-macromoleculaes and molecular docking to explor how the chemical structure differences effect on indirect antioxidant activity. The mechanism of flavonoids induce Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway will be studied on cellular level. This project will provide theory basis and instruction for the screening of natural and high-efficiency antioxidants and synthesising of novel antioxidants.

黄酮类化合物普遍存在于水果、蔬菜中，具有多种生物活性，是天然抗氧化剂的重要来源之一。清除自由基的抗氧化活性是其多种生物活性的生理基础。经典的“氢供体”理论解释了其与自由基反应的化学机理，然而，不足以解释低生物利用率的黄酮类化合物在细胞内的抗氧化活性。最新研究表明基于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的间接抗氧化是迄今最重要的内源性通路。本项目拟以不同结构的黄酮类化合物为研究对象，采用双荧光素酶报告基因细胞模型，获得抗氧化反应元件ARE的活性参数，构建QSAR模型，阐明黄酮类化合物间接抗氧化的构效关系；围绕信号通路的核心元件Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用，运用小分子与生物大分子互作分析手段结合分子对接的方法，从受体角度揭示黄酮类化合物结构对其间接抗氧化的影响规律，并从细胞水平探讨黄酮类化合物激活信号通路的分子机制，为天然高效抗氧化剂的筛选和新型抗氧化剂的合成提供依据和指导。

【背景】 黄酮类化合物在低生物利用率下仍能发挥多种生物活性，这与其作为信号分子参与细胞中的信号传导有关。Nrf2-ARE抗氧化信号通路是迄今为止发现的最重要的内源性间接抗氧化通路，其中Keap1-Nrf2蛋白相互作用的解离从而调控抗氧化反应元件ARE的转录表达是该信号通路激活的核心。然而，黄酮类化合物的结构如取代基的数目、位置、以及重要取代基团的种类如-OH、-OCH3等对于ARE激活能力的影响尚不清楚，基于Keap1-Nrf2蛋白复合物的黄酮类化合物激活ARE的分子机制尚未见报道。.【主要研究内容】（1）黄酮类化合间接抗氧化的定量构效关系研究；（2）黄酮类化合物与Keap1-Nrf2蛋白复合物相互作用的结构特征；（3）黄酮类化合物结构对激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响；.【重要结果】（1）黄酮类化合物的直接抗氧化活性不能反映其在生物体系中激活Nrf2-ARE信号通路的间接抗氧化能力。基于HepG2-C8荧光素酶报告基因系统发现黄酮类化合物激活ARE-荧光素酶的活性与其直接抗氧化的ORAC不具有相关性；初步的构效分析提示化合物分子结构中3′, 4′-邻二羟基结构不是黄酮类物质激活抗氧化信号通路所必需的，化合物结构中甲氧基基团的取代位点和数目也是激活活性的重要因素；定量构效分析提示黄酮类化合物形成氢键相互作用的结构特征和分子立体结构特征影响可能影响其激活Nrf2-ARE信号通路的能力。（2）鹰嘴豆芽素A与Keap1蛋白形成分子间氢键相互作用，通过Keap1途径激活Nrf2-ARE抗氧化信号通路发挥抗氧化损伤作用。蛋白免疫印迹和分子模拟的结果表明ARE-荧光素酶激活活性最强的鹰嘴豆芽素A能够与Keap1蛋白形成分子间氢键相互作用，通过非竞争性结合的方式促进Keap1-Nrf2蛋白相互作用的解离，促使Nrf2-ARE抗氧化信号通路的激活，在细胞水平发挥抗氧化损伤作用，是极具潜力的双功能抗氧化剂。（3）具有平面结构的多甲氧基黄酮橘皮素主要是通过非Keap1依赖的MAPK蛋白激酶途径激活Nrf2-ARE信号通路，在细胞水平发挥间接抗氧化活性。.【科学意义】基于Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用，阐明黄酮类化合物间接抗氧化的结构特征，并探索其激活Nrf2-ARE信号通路的分子机制将为寻找和合理利用天然黄酮类化合物作为抗氧化剂提供理论基础和科学依据。