柑橘黄酮类化合物的肠吸收构-效关系及关键外排蛋白作用机制研究

Flavonoids are ubiquitously compounds, presenting in the plant world and our common diet. Although epidemiological investigations and laboratory studies have indicated their pharmacological properties, it is a big challenge for flavonoids further development due to their low oral bioavailability. In this study, 30 kinds of flavonoids will be studied in vitro intestinal model Caco-2 monolayers, getting a quantitative structure permeability relationship (QSPR) to define the structural requirements of flavonoids necessary for high Papp. In order to find out limiting factor for low bioavailability and help on understanding the mechanism of the P-gp and MRP1, the affinity of flavonoids to this two crucial transporters will be studied in P-gp overexpression or MRP1 transfected KB cells. The results will be used to define the necessary structural requirements of flavonoids for affinity of P-gp or MRP1-mediated daunorubicin transport in the cellular models, and two quantitative structure affinity relationships (QSAfR) model will be obtained and analyzed. Flavonoids will docking with P-gp or MRP1 obtained by homology modeling to find their protein binding sites and binding mode. The expected results will compared with the data from QSAfR to get the essential structure combined with transporters. Taking the results of QSPR into account, the structure of flavonoids easy to be absorbed in intestine will be figured out and comfirmed by vivo intestinal and vitro intestinal model. The crucial structure information will be a useful reference for screening of high absorbtion rate flavonoids or its structural modification.

黄酮类化合物在植物界中大量存在并具多种活性，然而其口服后生物利用度较低严重制约其进一步应用。本课题以30种主要来源于柑橘的黄酮类化合物为研究对象，从肠道吸收转运角度，将其作用于Caco-2细胞，构建结构-渗透3DQSPR模型，比较不同结构黄酮类化合物肠道吸收的结构特征。为明确其肠吸收的限制因素，进一步研究两个关键外排蛋白P-gp和MRP1的作用机制，利用外排蛋白P-gp或MRP1过表达的KB细胞，将黄酮类化合物作用于外排蛋白介导的道诺霉素转运，构建两个结构-亲和力3D QSAfR模型，与同源模建得到的人P-gp或MRP1分别进行分子对接，寻找黄酮类化合物的蛋白结合位点及方式，和QSAfR结果对比、验证，获得黄酮类化合物与外排蛋白结合的必要结构。结合肠道吸收实验，分析肠道中易吸收的黄酮类化合物的关键结构位点。用在体肠道和体外肠道模型验证，为筛选或合成具有高吸收结构特征的黄酮类化合物提供依据。

【背景】黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，多项体外研究表明其具有包括抑菌、抗氧化、抗炎和抗癌等多种生理活性。但由于黄酮类化合物口服生物利用度低导致其体内活性不尽如人意。而其自身物理化学性质、代谢相关酶类以及各种转运蛋白等都会影响黄酮类化合物生物利用度。其中黄酮类化合物的理化性质及外排蛋白对其吸收作用机制的影响不甚清楚，报道极少。【主要研究内容】（1）Caco-2细胞单层膜模型的建立及评价；（2）黄酮类化合物肠吸收的QSAR研究；（3）外排转运蛋白对黄酮类化合物的转运调控研究；（4）外排转运蛋白与黄酮类化合物的分子对接研究。【重要结果】（1）采用透射电镜、测定细胞跨膜电阻和标志物透过率等多种方法对建立的Caco-2细胞单层膜模型进行评估，证实模型单层完整、有效。（2）黄酮类化合物转运实验表明，大部分黄酮类化合物吸收方式为被动扩散，仅有木犀草素，桑色素和花旗松素这3种黄酮类化合物的吸收有外排蛋白参与。此外，二维定量构效关系方程显示黄酮类化合物肠吸收随着QC3’（电荷效应）、E_sol（溶剂化自由能）、SlogP_V3（原子表面积贡献）和vsurf_ID1（分子平衡性）的增加而降低。（3）分别成功建立了两种关键外排蛋白P-gp和MRP2过表达的细胞模型。其中5, 7, 3’, 4’-四甲氧基黄酮、5羟基黄酮、汉黄芩素、山奈素、槲皮素、异鼠李素、花旗松素、水飞蓟宾和黄豆黄素为P-gp底物。而橘皮素、黄芩素、山奈素、花旗松素、二氢杨梅素、水飞蓟宾、黄豆黄素和刺芒柄花素为MRP2底物。与P-gp亲和力构-效关系研究表明：5-羟基、8-甲氧基、2’-甲氧基和4’-甲氧基的取代利于黄酮类化合物成为P-gp底物，而3-羟基、6-羟基、7-羟基和4’-羟基的取代则不利于其作为P-gp底物。5-羟基、6-羟基、7-羟基、6-甲氧基和4’-甲氧基取代利于黄酮类化合物成为MRP2底物，而8-甲氧基，4’-羟基和C-2，3双键等基团取代不利于黄酮类化合物成为MRP2底物。（4）同源模建的人P-gp和MRP2模型合理可靠。黄酮类化合物的对接打分与摄取量外排比之间良好的线性关系表明体外实验结果与分子模拟结果具有很好的一致性。【科学意义】黄酮类化合物肠吸收相关的结构位点解析对其生物利用度有重要指示作用，为高吸收黄酮类化合物的寻找和设计提供了重要依据。