Cry1Ia分泌相关序列的鉴定及其对蛋白稳定性和杀虫活性影响的研究

Bt Cry toxins have been used widely in pest control due to their specific insecticidal activity to many agricultural insects. Among them, Cry1I toxins are secreted proteins and show a wide range of specificity for different insect orders which are distinct from other Cry toxins. Unlike the emphasized insecticidal activities and action mode, the sequence regulation of Cry1I during translocation is seldom investigated. Previously, we observed significant degradation of Cry1Ia after deleting the N-terminal secretion signal peptide when expressed in Bt strain. In addition, a large quantity of expression products of the domain exchanged Cry1Ia mutants are retained inside cells, respectively. For reveal the secretion related regions and their full function in Cry1Ia, the proposed project is to construct several amino acid deletion mutants in the N-terminal secretion signal peptide, and screening regions contributing in keeping Cry1Ia protein stability. We will further identify the type of secretion pathway for Cry1Ia and screen the molecular chaperones interacting directly with the toxic protein in this pathway. Thereafter the chaperone binding sites in Cry1Ia will be preyed by yeast two-hybrid system. Finally, we will substitute these critical sites with other Cry sequences and detect the secretion, stability and insecticidal activity of these substitution mutants. This present project expects not only to screen the secretion related regions of Cry1Ia protein, but also to identify their function on protein stability and insecticidal activity. These findings would generate a new insight into substantial differences between Cry1I and its counterparts, and in consequence may bring new ways to modify Cry toxins.

Bt杀虫晶体蛋白具有特异的杀虫活性，广泛用于农作物病虫害防治。其中，Cry1I类蛋白对两个目的昆虫具有杀虫活性，且表达形式也与其它Cry蛋白不同。目前，有关Cry1I的研究主要集中在杀虫谱和作用机制等方面，对其胞外分泌的序列调控机制尚无深入研究。我们前期研究表明N-端信号肽的缺失显著降低了Cry1Ia在Bt细胞内的稳定性，而非信号肽序列的改变也会影响胞外分泌。为揭示Cry1Ia分泌相关序列及其功能，本项目拟首先通过信号肽的梯度缺失，鉴定其中维持蛋白稳定的关键区域。然后，构建可调控分泌途径的突变体细胞，判定Cry1Ia的分泌途径；筛选该途径中与之互作的蛋白及结合位点。最后，研究这些位点的变化对蛋白分泌、稳定性和杀虫活性的影响。本项目的实施不仅能明确调控Cry1Ia蛋白胞外分泌的关键序列，阐明其具体功能，而且将从蛋白转运的角度揭示与其它Cry蛋白差异的本质，为改造和利用Cry蛋白提供新的思路。

Cry1I蛋白是Bt杀虫蛋白中较为特殊的一个亚类，其特殊性在于缺失C端长肽，不形成伴孢晶体，以可溶形式分泌到胞外。研究表明该基因通常与Bt菌株的另一类重要杀虫蛋白Vip3A同时存在。目前为止，这些分泌型杀虫蛋白对Bt菌株的生态地位影响尚不明确。从杀虫活性的角度考虑，Cry1I对多个目的害虫有作用，比其它Cry蛋白表现出更广泛的杀虫谱。因此，对这个亚类的深入研究能够促进理解Cry蛋白的进化关系，为更好的开发和利用这种重要的生物杀虫剂奠定基础。本项目从Cry1Ia蛋白分泌相关序列着手，着重研究了其分泌信号肽（Iasp）与其它Cry蛋白N端序列的差异、转运重组蛋白的效率、对Cry1Ia本身的稳定性影响，以及潜在互作的分子伴侣等。结果显示：1）Iasp与Cry1B蛋白的N端序列氨基酸疏水性分布整体类似，但是第10-20个氨基酸有所差异；2）Iasp对eGFP蛋白(IeGFP)的转运效率很低，且其分泌途径可能属于先转运后折叠的机制；3）Iasp的存在能够防止Cry1Ia蛋白在Bt细胞内的降解；4）推测可能性最大的BtCsaA蛋白不能改善IeGFP蛋白的原核表达。这些研究结果对理解Cry1Ia蛋白与其它Cry蛋白的区别提供了重要数据。另外，在研究过程中，我们还发现一个Iasp的特殊作用，能够促进重组蛋白，如eGFP、GDF8和MMP13的表达，而Cry1B的N端序列无此功能，因此，可以作为一个新型的融合标签。这种促进作用是由于Iasp编码序列提高了融合基因的转录水平，当然，Iasp本身与分子伴侣的互作是否参与其中，暂时无法确定。Iasp对eGFP和mCherry蛋白表达的促进作用还导致宿主细胞的荧光信号显著增强，且对革兰氏阳性菌有效。因此，可以利用这种融合荧光蛋白作为新型的指示分子，以提高对靶标细胞、启动子等监测灵敏性。Iasp的新用途提示可以进一步开发Cry蛋白或局部序列的特殊应用。