基于核酶剪切产物的特异性应用Helicos DRS 测序技术发现新核酶的研究

Ribozymes are catalytic RNA molecules，most of them could cleave RNAs and have great potential in the gene therapy for tumor and viral diseases. Although there are many natural ribozymes, due to the time-consuming, laborious and indirect discovery methods, so far, there are only 14 classes of ribozymes discovered in living organisms and very few of them can be applied for gene therapy which require ribozymes with high cleavage efficiency, specificity and good plasticity. Therefore, building a fast，direct and reliable ribozyme detecting method is an urgent task to discover more new ribozymes. The research project takes advantage of the fact that the 5′cleavage product contains a unique phosphate group at its 3′end, and therefore after dephosphorylation a poly A tail can be appended specifically to the 3′end.Then, the Helicos direct RNA sequencing (DRS) technology is used to directly sequence the cleavage products with poly A tails to discover new ribozyme candidate sequences and bioinformatics is applied to predict structures of these candidate sequences which will be screened through for conserved structures and finally the simple ribozyme verification approaches developed previously by our group will be used to verify these ribozymes. We will apply this direct, simple, quick and sensitive approach to discover new ribozymes from a wide-range of biological samples, and therefore to build a foundation for ribozyme’s application in gene therapy.

核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，大多数具有剪切RNA的功能, 在肿瘤和病毒性疾病的基因治疗方面极具应用潜力。虽然生物体里有许多核酶存在，但由于以往的研究方法比较费时、费力且带有随机性，目前发现的核酶仅有14类，而且可应用于疾病基因治疗的具有酶切速率高、专一性强、可塑性好的核酶更少。因此，建立快速、简便、可靠的核酶检测方法是发现新核酶迫切需要解决的问题。本项目利用核酶5′端酶切产物的3′末端带有磷酸基团的特点，创新地在3′末端添加多聚A尾巴，结合高通量Helicos的直接RNA测序(DRS)技术，检测带多聚A尾巴的剪切产物，发现新核酶的候选序列；并运用生物信息学对候选序列进行结构预测和筛选；最后运用前期研究中建立的简便的核酶验证方法发现新的核酶。我们将应用这个更直接、简便、快速、灵敏的新方法从广泛采集的生物样品里发现更多新的核酶，进而为核酶在基因治疗中得以应用奠定基础。

大多数核酶具有剪切RNA的功能, 在基因治疗方面极具应用潜力，但是可用于基因治疗的核酶种类很少。本研究利用核酶剪切产物的特点，创新地在产物末端添加多聚A尾巴，结合高通量测序技术，检测到剪切产物。但是我们发现高通量测序技术的灵敏度不够高，无法检测到剪切产物。虽然我们采用了许多不同的方法进行产物末端修饰，希望提高特异性和灵敏度，但是高通量测序技术仍然无法检测到核酶。因此，我们改变了策略。我们利用生物信息学建立新的流水线（CM-line）发现结构化非编码RNA。一方面在不同物种里发现结构化非编码RNA，另一方面测试它们的功能，希望发现新的核酶。结果：我们建立了一个具有以下特征的管道（CM-line），用于发现结构化ncRNA。首先，我们选择了具有较大遗传距离的物种以促进发现共变异和兼容变异。其次，我们使用了 CMfinder，它可以对低保守性序列进行比对分析。第三，我们去除了重复序列和已知的ncRNA，以减少CMfinder 的工作量。第四，我们用Infernal寻找更多的代表。我们报告了 11 类结构化 ncRNA 候选者。功能分析表明它们可能具有多种功能，有些可能通过聚 (A) 尾巴调节生物钟基因；有些可能通过与 RNA 结合蛋白合作调节延伸因子 和 T 细胞受体信号通路；有些可能是核酶。我们建立的CM-line还可以为用于分析其他大型基因组，发现结构化ncRNA 及其功能的鉴定。.此外，我们还利用结构化非编码RNA进行肠道菌的分类。细菌，尤其是肠道细菌在人类健康和疾病中发挥着重要作用。16S 核糖体 RNA (rRNA) 对许多细菌属的分类由于种间分辨率低，对有些关系密切的物种无法区分。鉴于核糖开关的广泛分布在细菌中，它们可能有助于 16S rRNA 区分密切相关的物种。我们发现在 28 组 16S rRNA 无法区分的物种中，有 8 组可以被 TPP 核糖开关和其他核糖开关分开。此外，我们使用 Klenow DNA 聚合酶和一对短引物来促进文库构建用于测序的 TPP 核糖开关。测序结果表明，TPP 核糖开关可以检测到类似于 16S rRNA检测到的主要的物种。因此，TPP 核糖开关和其他核糖开关类可以应用于肠道细菌分类。