细菌适应性与碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌克隆传播的相关性及其机制研究

Worldwide spread of resistant Acinetobacter baumannii has been common, especially CC92 clonal complex. The preliminary study has proved the clonal dissemniation of resistant CC92 in Huashan Hospital. It is presumed that CC92 has got high fitness through gene evolution. It has competitive advantage under the antibiotic selective pressure and without antibiotics, spread widely in clinial circumstance and become predominant clones. In order to prove the high fitness of resistant CC92 clonal complex and explore its mechanism, the in vitro and in vivo model will be established to evaluate the fitness of bacteria, the fitness of CC92 and non-CC92 will be compared, and the reason of increased resistance of Acinetobacter baumannii will be explored. In addition, the mechanism of high fitness of CC92 will be studied by means of Genome-wide association study (GWAS). The knockout mutant and restore strains will be built and the fitness will be compared. The research will study the reason of wide spread of resistant CC92 from bacterial micro perspective and explore the molecular mechanism in order to provide new view and theoretical basis to reduce the resistance of bacteria.

近年来世界范围内耐药鲍曼不动杆菌克隆传播已非常普遍，尤其是CC92克隆复合体，先期研究已证实华山医院存在CC92耐药克隆传播。推测CC92耐药克隆可能已经通过基因进化获得了高适应性，在抗菌药物选择压力下和无抗菌药物存在的自然环境中获得竞争优势，从而在临床广泛传播成为优势克隆。本研究旨在证实CC92耐药克隆的高适应性并对其机制进行研究，通过联合体外培养和动物模型建立全面评价细菌适应性的新方法，比较碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌CC92和非CC92菌株的适应性，探讨鲍曼不动杆菌耐药率上升的原因；通过全基因组关联研究，探索CC92克隆高适应性的机制，并构建高适应性相关基因的敲除突变株和回复突变株，比较其适应性，从而明确CC92适应性增高的机制。本研究拟从细菌微观角度，通过适应性的比较，来明确CC92耐药克隆广泛流行的原因，并对其相关分子机制进行研究，为降低细菌耐药性提供了新的视角和理论依据。

近年来世界范围内耐药鲍曼不动杆菌克隆传播已非常普遍，尤其是CC92克隆复合体，先期研究已证实华山医院存在CC92耐药克隆传播。推测CC92耐药克隆可能已经通过基因进化获得了高适应性，在抗菌药物选择压力下和无抗菌药物存在的自然环境中获得竞争优势，从而在临床广泛传播成为优势克隆。本研究旨在通过全基因组序列分析，探索CC92克隆高适应性的机制，并构建高适应性相关基因的敲除突变株和回复突变株，比较其适应性，从而明确CC92适应性增高的机制；同时开展回顾性病例对照研究分析，明确鲍曼不动杆菌血流感染危险因素。收集GenBank数据库上具有全基因组序列的鲍曼不动杆菌基因序列，并比较CC92菌株基因组与非CC92菌株基因组序列的差异，发现1个由3个基因组成的基因簇（2736bp）存在13/15株（86.7%）CC92菌株中，而27株非CC92菌株中，仅有1株携带有该基因簇，推测此基因簇可能与CC92的克隆播散有关。我们将此基因簇命名为AbMMP。AbMMP基因簇由3个基因组成，AbMMP-1的结构域为LysM，AbMMP-2的结构域为肽酶家族M23，两个基因均注释为金属内肽酶样膜蛋白，AbMMP-3为信号肽结构。收集华山医院2004-2013年血培养分离到的84株鲍曼不动杆菌进行AbMMP基因检测，发现98.3%的CC92菌株携带AbMMP基因，而非CC92菌株中仅29.2%携带该基因。通过质粒同源重组法敲除临床菌株AB58的AbMMP基因，构建敲除株 AB58ΔAbMMP。透射电镜下，敲除株AB58ΔAbMMP细胞膜结构完整性被部分破坏，伴有皱褶、连续性中断。构建小鼠免疫抑制肺炎模型，通过气管插管法接种菌液。临床株AB58组病死率为60%，敲除株AB58ΔAbMMP组病死率为20%，AB58组病死率较高。提示AbMMP基因簇可能与鲍曼不动杆菌毒力有关。通过病例对照研究发现，与鲍曼不动杆菌非血流感染相比，鲍曼不动杆菌血流感染的独立危险因素包括先前使用糖皮质激素、质子泵抑制剂，留置颅内引流管。本研究通过分子机制的研究和回顾性病例对照研究分析，明确了鲍曼不动杆菌CC92耐药克隆广泛流行的原因和鲍曼不动杆菌血流感染危险因素，为降低细菌耐药性提供了新的视角和理论依据。