富集孕母血浆中cffDNA的新方法学探索及其在无创性产前诊断中的应用研究

出生缺陷已严重威胁国民素质和生活质量，在我国情况尤为严重。染色体病是引起出生缺陷的主要病因，地中海贫血是我国南方地区另一种造成出生缺陷的主要病因。目前以上出生缺陷都无法治愈，产前诊断仍然是有效预防出生缺陷的重要手段。然而，产前诊断所需要的胎儿取材主要依赖于有创性手术，这些手术不仅可造成手术并发症，还可导致1-5％的流产概率。因此，无创性产前诊断技术是产前诊断学科发展的重要和长期目标。孕妇血浆中cffDNA的发现为无创性产前诊断开辟了广阔的应用前景，尽管国内外多项研究已取得令人瞩目的成果，但离临床应用还相差甚远，目前限制cffDNA在无创性产前诊断中应用的主要原因是缺乏有效富集孕妇血浆中cffDNA的方法。本研究是希望能在课题组前期研究的基础上，通过多种方法的探索，建立有效、简单的富集cffDNA的新方法，并用建立的新方法进行常见染色体病与地中海贫血的无创性产前诊断应用。

出生缺陷已严重威胁国民素质和生活质量，在我国情况尤为严重。染色体病是引起出生缺陷的主要病因，地中海贫血是我国南方地区另一种造成出生缺陷的主要病因。目前以上出生缺陷都无法治愈，产前诊断仍然是有效预防出生缺陷的重要手段。然而，产前诊断所需要的胎儿取材主要依赖于有创性手术，这些手术不仅可造成手术并发症，还可导致1-5％的流产概率。无创性产前诊断技术是产前诊断学科发展的重要和长期目标。孕妇血浆中cffDNA的发现为无创性产前诊断开辟了广阔的应用前景，尽管国内外多项研究已取得令人瞩目的成果，但离临床应用还相差甚远，目前限制cffDNA在无创性产前诊断中应用的主要原因是缺乏有效富集孕妇血浆中cffDNA的方法。在2011年~2012年期间，本研究通过高通量甲基化芯片分别检测脐血和孕妇外周血，筛选得到310个胎儿DNA的甲基化标记物，然后结合重亚硫酸盐限制性内切酶法与测序法验证了由芯片筛选到的在胎盘组织与胎儿取材中高度甲基化的15个基因，这些基因可成为无创性产前诊断研究的胎儿DNA标记物。基于此项研究发现，尝试摸索用甲基化DNA富集MBD蛋白对孕妇血浆游离DNA进行富集的方法。2012~2013年期间，由于高通量测序的快速发展，本研究应用新的第二代测序平台Ion Proton半导体测序进行无创产前检测，建立一套4天可出检测报告的无创产前非整倍体检测实验流程和数据分析方法，通过与核型结果比较，该方法准确度高于99%，达到国际领先水平。除此之外，本研究还尝试设计多重PCR引物，扩增地中海贫血基因，结合高通量测序技术，进行无创性地中海贫血检测。