A型核纤层蛋白C-末端磷酸化调控细胞衰老及其通路的研究

DNA damage accumulation is one of the most profound mechanisms underlying aging and premature aging. The nuclear matrix protein lamin A is the multi-functional protein which involves in DNA replication and repair, gene activation, transcriptional regulation, formation and maintenance of higher-order structure of chromatin. Furthermore, the phosphorylation of lamin A is the main cause of its mobility in the nucleus and the nuclear membrane dissolution during mitotic phase. On the basis of our research that lamin A C-terminal mutation triggers the cellular senescence, recently we found that lamin A C-terminal region was interacting with specific protein kinase. The aim of this study is to investigate whether the dysfunction of lamin A C-terminal phosphorylation directly affect its translocation from nuclear lamina to nucleocytoplam and the functions of chromatin-associated proteins which also bind with lamin A in laminopathy-based premature mouse model. Further to explore whether the functional alternation of lamin A C-terminal specific phosphorylation triggers DNA damage-induced chromatin remodeling and modulating cellular senescence. The goal of our study is to uncover the upstream mechanism of lamin A C-terminal phosphorylation involving in the regulation of genomic instability and premature aging. These studies will help to identify aging factors and markers in new epigenetic perspective, and provide potential therapeutic targets of aging-related diseases.

DNA 损伤修复缺陷是导致早老与衰老的重要原因之一。而核纤层蛋白A(lamin A)是参与DNA复制与损伤修复、基因活化、转录调控、形成和维持染色质高级结构的多功能重要蛋白质，lamin A的磷酸化修饰是它在细胞核内运动迁移并导致核膜溶解的主要原因。我们在长期研究lamin A的C末端突变引发细胞早老发生机制的基础上，发现lamin A C-末端与特异磷酸激酶存在相互作用。本项目将以小鼠早老症模型为研究对象，重点探讨lamin A C-末端特异位点磷酸化功能异常是否直接改变lamin A在细胞核迁移定位并影响与lamin A结合的染色质相关蛋白功能，进一步导致染色质重塑障碍、DNA损伤修复延迟及细胞衰老。预期结果将揭示lamin A C-末端特异位点磷酸化参与调控基因组不稳定性所致细胞衰老的上游机制。本项目也为从表观遗传学的新视角筛选衰老因子和标记，寻找干预衰老的新靶点提供良好的应用价值。

A 型核纤层蛋白（lamin A）是参与 DNA 复制、DNA 损伤修复、基因表达、转录调控、端粒动力学和维持染色质结构的多功能重要蛋白质。其磷酸化修饰是它在细胞核内运动迁移，参与调节多种蛋白功能和启动细胞周期核膜溶解的重要基础。然而目前对于 lamin A 的磷酸化功能调控知之甚少，并且 lamin A 上大多数磷酸化位点的功能重要性仍未有报道。目前已知 LMNA 基因 G608G 突变导致 lamin A C-端缺失 50个氨基酸，形成异常 lamin A（progerin）在核内堆积并引发细胞衰老。本研究的目的在于寻找 lamin A C-末端缺失的关键磷酸化位点及其特异的磷酸激酶，探讨位点磷酸化对于 laminA 核内定位及细胞衰老通路的影响。本项目首先通过生物信息方法筛选 lamin A 缺失肽段高转换的磷酸化位点，通过构建位点突变质粒进行 293T 细胞转染，免疫沉淀分析 lamin A 特异位点磷酸化水平，发现关键位点的突变显著影响 lamin A 的整体磷酸化。制备了关键位点的磷酸化抗体，通过免疫共沉淀及体内外激酶实验，证实磷酸化关键位点的激酶。此外，通过慢病毒表达系统构建lamin A 突变体细胞，检测磷酸化位点失活对 lamin A 核内分布及细胞衰老的影响。结果发现（1）本研究鉴定了 lamin A 的两个重要磷酸化位点 Ser628 及 Ser636，发现Ser628 和 Ser636 位点的突变降低了 laminA 蛋白的整体磷酸化水平。（2）我们证实了糖原合酶激酶 3 β（GSK3β）与 lamin A 存在相互作用并磷酸化 lamin A Ser628 位点。（3）同时发现酪蛋白激酶 II（CK2）磷酸化 lamin A Ser636 位点，并通过此位点的激活参与调控 GSK3β 对 lamin A 的磷酸化作用。（4）我们通过慢病毒感染构建 Ser628 和 Ser636点突变细胞，发现位点磷酸化失活影响 lamin A 核内分布。5）Ser628、Ser636 位点失活影响细胞增殖并且导致细胞衰老。