量子点标记A型核纤层蛋白前体及在衰老中的应用研究

Modern society faces an increasing aging problem, and China is becoming an aging society at a very fast pace. Research on aging mechanisms leading to better diagnosis and prevention of age-related disease is increasingly important. However, human life span is relatively long making it difficult to study. Accelerated aging disorders in humans provide ideal model systems to understand the aging process since the accelerated aging syndromes usually recapitulate the normal aging process in many tissues. Our previous results indicate that if the C-terminal of prelamin A can not be cleaved or is cleaved abnormally，a premature aging syndrome will occur. The nuclear prelamin A specific recognition factor Narf participates in the cleavage process and is associated with cell senescence. Quantum dots (QDs) have been widely used as novel ?uorescent probes in biosensor and bioimaging due to their unique optical and electrical properties. In this program, we will use quantum, dot technology to label prelamin A and Narf and follow there localization both in proliferative and senescent cells in culture. We will also determine whether expression of prelamin A is cytotoxic, using Mitotracker staining and flow cytometry, and if co-expression of Narf reverses that toxicity. Furthermore, through dynamically folliwung the localization of both proteins, we will determine their subcellular site of interaction. Fluorescence resonance energy transfer and synchronous fluorescence techniques will be used to further explore of the determinants of interaction between Narf and prelamin A. Our findings will generate a better understanding of the interaction between prelamin A and Narf, leading to important knowedge about cell senescence and aging.

核纤层蛋白前体A（prelamin A）的C末端不能被剪切或加工异常均导致衰老。Prelamin A 的C末端特异识别因子Narf参与其剪切并与细胞衰老有关。本项目拟利用水热合成法制备具有独特荧光性质的量子点，并通过抗体和抗原的强特异性结合及细胞对量子点的内吞作用标记Prelamin A和 Narf。同时采用细胞形态学结合流式细胞检测凋亡技术，研究量子点对细胞的毒性。通过对量子点标记的Narf与prelamin A作用的实时动态示踪，研究Narf与prelamin A的作用位点，以及蛋白运动对衰老的影响。同时利用荧光共振能量转移和同步荧光扫描技术，研究Narf与细胞受体prelamin A结合的精细行为，探索Narf与prelamin A相互作用规律。本项目研究结果将揭示Prelamin A和 Narf相互作用对衰老的影响。

衰老问题是当今社会研究的重点之一。Lamin A 是重要的细胞核纤层组分，其基因突变可引起异常衰老。通常细胞中Lamin A以其前体prelamin A形式存在，有研究表示prelamin A的C末端不能被剪切或加工异常均导致衰老，而Prelamin A的C末端特异识别因子Narf参与其剪切并与细胞衰老密切相关。但是目前关于prelamin A与Narf的作用机理尚不清楚，对于其如何影响早老症的发病机制尚不明确。而常用的研究蛋白相互作用的技术（如GST-pull down、免疫共沉淀、GFP荧光蛋白等），虽然可以给出蛋白在细胞中相互作用的定位情况，但均无法动态的获取蛋白在细胞中作用的信息。量子点因具有发射光谱窄、荧光寿命长、量子产率高等优点，并可实时动态示踪蛋白在细胞中的作用，作为荧光探针在生物领域有着广泛的应用。. 因此，本项目首先利用水热合成法制备具有独特荧光性质的锌基量子点，并通过抗体和抗原的强特异性结合标记Prelamin A和 Narf。同时采用流式细胞检测凋亡技术以及荧光光谱技术，研究量子点的光学特性（用于离子和药物检测）和生物学特性（如细胞毒性、抗菌性等）。然后通过对量子点标记的Narf与prelamin A作用的实时动态示踪，研究Narf与prelamin A的作用位点，以及蛋白运动对衰老的影响。最后利用FRET和同步荧光扫描技术，研究Narf与prelamin A结合的精细行为。.在项目开展期间，项目已取得的重要结果如下：.（1）成功制备了良好水溶性、无毒的锌基量子点，并通过XRD、TEM、IR、紫外及荧光等技术表征了量子点的粒径和形貌。.（2）采用荧光猝灭技术，成功使用锌基量子点特异性检测芍药苷、槲皮素以及铜离子，并发现合成的锌基量子点具有较好的抗菌性能。.（3）考察了锌基量子点的细胞毒性，发现Zn基量子点具有较弱的细胞毒性。.（4）通过亲和素和生物素的强特异性结合作用，完成了锌基量子点对蛋白prelamin A和Narf的标记，并通过示踪蛋白运动，确定了prelamin A和Narf相互作用区域。.（5）利用FRET和同步荧光扫描技术，考察了量子点标记的Narf与prelamin A结合类型和结合力的大小。. 本项目的研究结果揭示了Prelamin A和Narf相互作用对衰老的影响，为研究早老症的发病原因和分子机制提供理论和实验基础。