E3泛素连接酶SPSB家族蛋白与诱导型一氧化氮合酶等靶蛋白的复合物结构和相互作用抑制剂研究

The SPRY domain-containing SOCS box proteins (SPSB1 to 4) are a family of four proteins that consist of a central SPRY domain and a C-terminal SOCS box. We have recently solved the crystal structure of SPSB2 (Kuang, et al. J Mol Biol. 2009), and have shown that SPSB1, 2, 4 are novel negative regulators of inducible nitric oxide synthase (iNOS); they bind to the N-terminus of iNOS via their SPRY domains and target iNOS for ubiquitination and proteasomal degradation. Activated SPSB2-deficient macrophages produced significantly more nitric oxide (NO) and had enhanced Leishmania killing compared to control macrophages (Kuang, et al. J Cell Biol. 2010). The aims of this project are to determine the structural basis for the SPSB2-iNOS interaction and develop small molecule inhibitors thereof through fragment-based approaches. Such molecules will enhance nitric oxide production and may have potential therapeutic applications in pathogen and cancer cell killing. On the other hand, SPSB3 does not interact with iNOS. In this project we will use phage display and affinity-column purification methods to identify the binding motif and cellular protein target of SPSB3.

SPSB家族蛋白含有SPRY结构域和SOCS盒。项目申请人解析了SPSB2的晶体结构(Kuang, et al. J Mol Biol. 2009)，并率先阐明了SPSB1,2,4通过SPRY结构域与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)结合而介导iNOS的泛素化和蛋白酶体降解；SPSB2基因敲除巨噬细胞中iNOS和一氧化氮(NO)增加并加速对利什曼原虫的杀灭(Kuang, et al. J Cell Biol. 2010)，提供了通过干预SPSB与iNOS相互作用来增强免疫细胞NO产生，促进杀灭病原微生物(如结核杆菌和疟疾)或癌细胞的全新思路。本课题将解析SPSB2-iNOS氨基端复合物结构，并通过基于片段的NMR筛选发现可以抑制SPSB-iNOS相互作用的分子先导结构。另一方面，SPSB3不与iNOS结合而其靶蛋白未知。本课题将鉴定SPSB3的特异结合序列和细胞内靶蛋白，从而揭示其生物学功能。

SPSB蛋白家族的4个成员（SPSB1,2,3,4）都含有SPRY结构域和SOCS盒。SPSB1、SPSB2和SPSB4通过SPRY结构域与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）结合，从而介导iNOS的泛素化与蛋白酶体降解。抑制SPSB2与iNOS的结合，可以增加一氧化氮（NO）产生，可能可以促进杀灭病原微生物或癌细胞。另一方面，SPSB3 不与iNOS 结合而其靶蛋白国内外文献未见报道。. 在本项目资助下，我们解析了SPSB2蛋白调控iNOS的结构基础，并设计干扰SPSB-iNOS相互作用的抑制肽，研究了抑制肽与SPSB2的相互作用并解析了复合物的结构。此外通过免疫共沉淀和质谱分析鉴定SPSB3的相互作用蛋白。. 我们使用核磁共振（NMR）波谱和等温滴定量热法（ITC），分析SPSB2蛋白SPRY结构域与iNOS氨基端短肽K9以及与设计的环状抑制肽cR8的相互作用。NMR分析表明cR8与SPSB2蛋白SPRY结构域的iNOS结合位点结合。ITC法测得K9与SPSB2的亲和力为10 + 1 nM；cR8与SPSB2的亲和力为699 + 104 nM。我们解析了分辨率为2.7 Å的SPSB2-K9复合物的晶体结构，以及分辨率为1.3 Å的SPSB2-cR8复合物的晶体结构。我们通过外源性过表达和细胞穿透肽两种方法研究了iNOS氨基端短肽对RAW264.7细胞NO产生水平的影响，结果表明外源性iNOS氨基端短肽可以增加细胞NO的产生。此外，在293T细胞和A549细胞中过表达全长以及不同截短片段的SPSB3蛋白，通过免疫共沉淀和质谱鉴定分析SPSB3的相互作用蛋白。通过生化实验验证，证实一种参与调控蛋白质甲基化修饰的酶是SPSB3的细胞内相互作用蛋白。. 以上研究成果为深入了解SPSB蛋白对iNOS的调控以及设计抑制剂分子提供了结构基础，并为进一步研究SPSB3的生物学功能奠定了基础。.