宿主和病毒通过E3泛素连接酶TRIM25调控RLR-MAVS固有免疫信号通路的结构基础和干预分子研究

RIG-I-like receptors (RLRs, including RIG-I, MDA5, and LGP2) are pattern recognition receptors that sense viral RNA and trigger innate immunity responses. Upon activation by viral RNA, RIG-I and MDA5 undergo conformational change and interact with the mitochondrial bound protein MAVS (IPS-1/VISA/Cardif）to induce signalling. Ubiquitination of RIG-I and/or MAVS, mediated by the E3 ubiquitin ligase TRIM25, is crucial to this process. However, molecular mechanism for the TRIM25-RIG-I/MAVS interactions and the generation of coupled or uncoupled K63-ubiquitin chains remains elusive. This project aims to investigate the molecular interactions among TRIM25, RIG-I and MAVS. Moreover, viruses developed various strategies to overcome the host RLR-MAVS system. We will investigate how the NS1 protein of influenza A virus antagonize RIG-I and TRIM25, and will develop small molecule inhibitors targeting NS1 protein through fragment-based NMR screening.

RIG-I样受体（RLRs，包括RIG-I、MDA5、LGP2）是细胞抵御病毒入侵的模式识别受体。当RIG-I和MDA5与病毒RNA结合时发生构象改变并与线粒体外膜上的MAVS蛋白结合进而激发固有免疫反应。这一过程依赖于宿主细胞E3泛素连接酶TRIM25介导的RIG-I和/或MAVS分子寡泛素化，但目前对于TRIM25如何与RIG-I或MAVS相互作用并产生共价或非共价结合的寡泛素链仍不清楚。本项目将对这一悬而未决的重要科学问题进行探索，通过生物物理学方法研究TRIM25与RIG-I及MAVS间可能存在的相互作用和复合物结构。另一方面，不同病毒发展进化出多种针对RLR-MAVS信号通路的逃避机制。我们将研究甲型流感病毒NS1蛋白拮抗RIG-I和TRIM25等宿主蛋白的具体机制和结构基础，并通过基于片段的NMR筛选新方法寻找抑制NS1蛋白的小分子，作为研发抗病毒创新药物的第一步。

宿主细胞抗病毒天然免疫反应信号通路依赖于E3泛素连接酶TRIM25和RNF135（又名Riplet、RUEL）介导的RIG-I分子寡泛素化。最新的研究表明RNF135/Riplet（而不是TRIM25）才是促进RIG-I信号通路激活所必需的关键E3泛素连接酶（Cadena, et al. Cell, 2019），但目前RNF135蛋白的晶体结构或溶液结构仍未被报道，它与RIG-I相互作用的结构基础仍不清楚。在本项目资助下，我们研究了RNF135蛋白PRY-SPRY结构域的结构特征及其与RIG-I蛋白的相互作用。我们通过生物物理学方法发现RNF135蛋白PRY-SPRY结构域与RIG-I蛋白CTD在体外并无直接相互作用，因此未能制备两者的复合物及解析复合物的晶体结构。我们进行了RNF135蛋白PRY-SPRY结构域的溶液核磁共振研究并完成了主链的化学位移归属，为使用核磁共振方法研究该结构域的溶液结构及其与RIG-I分子其他区域、RIG-I/dsRNA复合物、及其他蛋白的相互作用奠定了基础。我们发现RNF135蛋白PRY-SPRY结构域N端在溶液中不形成稳定的alpha-螺旋，与之前报道的多个其他蛋白的PRY-SPRY结构域的晶体结构不同。我们通过核磁共振波谱比较了野生型RNF135蛋白PRY-SPRY结构域及可以导致MMFD综合症（一种过度生长综合症）的R286H突变体，发现该突变并不影响结构域的整体结构。另一方面，针对同样含有SPRY结构域并调控宿主天然免疫反应的E3泛素连接酶SPSB2，我们设计了系列环状抑制肽，解析了SPSB2非结合状态晶体结构以及多个SPSB2-环状抑制肽复合物的晶体结构，阐明了构效关系，论文发表后已被Nature Reviews Drug Discovery和Chemical Reviews等国际权威期刊的综述文章正面引用和用于作图。以上研究成果有助于深入了解RNF135和SPSB2等调控宿主抗病毒天然免疫反应的E3泛素连接酶的结构与功能以及相关抑制剂分子的研发。