鲶爱德华氏菌多拷贝质粒pEI1和pEI2编码的毒力蛋白的分子致病机理研究

鲶爱德华氏菌是一种革兰氏阴性胞内杆菌，能在宿主巨噬细胞内存活并繁殖,是鲶形目鱼类的重要病原。其携带的多拷贝质粒pEI1和pEI2与致病性相关，但分子致病机理不清。本研究拟构建含SacB负选择与Km正选择标签的同源自杀质粒以消除pEI1和pEI2，在此基础上构建多拷贝毒力基因的缺失突变株；通过感染与细胞分相阐明pEI1的ORF1是否为Ⅲ型分泌系统效应分子, 并研究ORF1与宿主的相互作用，包括ORF1对粘附、侵袭与繁殖的影响、在对抗巨噬细胞免疫杀伤中的作用、ORF1过表达引起的细胞和组织病理，并通过ORF1在宿主细胞的亚细胞定位及可能的宿主靶蛋白筛选，研究其信号通路；研究pEI2的ORF1是否为T3SS的分子伴侣，并筛选其靶蛋白。本项目从多拷贝质粒编码的毒力因子与宿主的相互作用角度开展研究，不仅揭示了质粒的致病机制，亦为以pEI1为载体表达保护性抗原的鲶爱德华氏菌重组弱毒苗的研制奠定基础。

鲶爱德华氏菌对黄颡鱼及斑点叉尾鮰等鲶形目鱼类的养殖造成重大经济损失，但目前对其致病机理不清，免疫防治手段尚未建立起来。本项目对鲶爱德华氏菌自身携带的多拷贝质粒pEI1和pEI2的质粒基因组序列进行了测定，发现其编码三个蛋白EseH, EscD和EseI，其中EseH和EseI可进入宿主细胞，为Ⅲ型分泌系统的效应分子。通过质粒不相容性原理对多拷贝质粒进行消除，以构建这三个基因的缺失突变株，分析了其在粘附及侵袭宿主细胞中的作用，并通过竞争感染实验及半致死浓度的测定，阐明了其在鲶爱德华氏菌致病中的作用。此外，阐明了鲶爱德华氏菌和迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因簇上均有分布功能未知蛋白EseE和EscE，以及Ⅲ型分泌系统输送器蛋白EseB的分子致病机理。重要结果为：建立了多拷贝质粒编码基因的敲除方法，阐明了致病性质粒的分子致病机理；阐明了EseE一方面作为输送器蛋白EseC的分子伴侣，另一方面作为调控蛋白，正调控输送器蛋白EseB, EseC 和EseD所在操作子；阐明EscE通过自身的分泌或者转运精确控制其本身在细菌胞内的蛋白水平，从而控制效应分子的转运、输送器蛋白的分泌，从而控制鱼类爱德华氏菌在宿主体内的致病性；阐明EseB通过在菌体表明形成纤丝状结构，纤丝间的相互链接导致了聚集及生物膜的形成。这些研究结果为人们揭示了鲶爱德华氏菌以及感染鱼类的迟缓爱德华氏菌的部分分子致病机理，为针对Ⅲ型分泌系统的高效免疫预防策略的提出奠定了理论基础。