杀鱼爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统输送器蛋白的分子致病机理研究

Based on multiple phylogenetic analyses and the genome-level comparisons, Edardsiella tarda PPD130/91 was renamed as E. piscicida PPD130/91. Edwardsiella thus include three species that infect fish host, E. anguillarum, E. piscicida and E. ictaluri. Each of them encode a highly homologous type III secretion system 2, which secrete EseBCD to form pores on host membrane to deliver effectors into host. Interestingly, our preliminary research found that EseB is involved in biofilm development when cultured in T3SS inducing medium DMEM. In this study, we are to explore the relationship of biofilm development and the infection of fish host, and to find an applicable way to protect fish from being infected by Edwardsiellar species. To this aim, we are first to compare the contribution of EseB, EseC and EseD to the development of the filamentous appendage on the surface of Edwardsiella piscicida; then we are to determine if the filaments will facilitate the communication of material intercellularly; after that, we are to unravel if the development of the biofilm correlates to the successful infection of fish host. Based on the illustration of the molecular mechanism of the transcolon proteins in the pathogenesis of Edwardsiellar piscicida, the avirulent Edwardsiella strain PPD125/87 will be used to express and deliver translocon protein(s) to fish host by immersion inoculation and the protection efficiency of the recombinant vaccine will be evaluated.

Ⅲ型分泌系统及生物膜在病原菌的致病过程中扮演重要角色。杀鱼爱德华氏菌是牙鲆、大菱鲆等经济鱼类的主要病原菌，其基因组也编码了Ⅲ型分泌系统。我们前期研究发现杀鱼爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统输送器蛋白EseB参与菌体表面纤丝的组装和生物膜形成。本项目拟分离纤丝，鉴定纤丝的蛋白组份，并揭示这些蛋白对生物膜形成的“贡献”，同时比较Ⅲ型分泌系统输送器蛋白EseB、EseC和EseD在纤丝组装及生物膜形成中的作用。探究纤丝是否促成杀鱼爱德华氏菌与其它病原菌之间生物膜的形成，以及生物膜形成与杀鱼爱德华氏菌致病力之间的关系。另一方面，拟以输送器蛋白作为亚单位疫苗，评估其对杀鱼爱德华氏菌易感宿主的保护力。这些研究的开展将有助于阐明Ⅲ型分泌系统输送器蛋白的分子致病机理，并为研制针对输送器蛋白的实用新型鱼用疫苗奠定基础。

生物被膜的形成能使病原菌抵御宿主的免疫杀伤，并能削弱抗生素的抑菌/杀菌作用。项目前期在模拟体内环境的诱导型培养基中，我们发现野生型杀鱼爱德华氏菌发生聚集，而Ⅲ型分泌系统输送器蛋白缺失后（ΔeseB）不发生聚集。以这个表型为出发点，我们开展了本项目的研究工作。研究发现在Ⅲ型分泌系统诱导型培养基中，输送器蛋白EseB可以在菌体表面形成纤丝结构，介导细菌之间的相互作用，促进聚集和生物被膜的形成。EseB蛋白是纤丝的核心组份。以EseB作为阳性对照，研究杀鱼爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统另外两个输送器蛋白EseC和EseD在生物被膜形成中的作用。发现EseC抑制杀鱼爱德华氏菌聚集和生物被膜的形成，而EseD则不参与这一过程。EseC对杀鱼爱德华氏菌早期聚集和生物被膜的抑制作用是由于胞内EseE蛋白被EseC蛋白所结合，不能有效上调escC~eseE操纵子内eseB基因的转录；在细菌生长的平台期，输送器蛋白EseC的大量分泌，使得分子伴侣从EseC上游离下来，EseE结合在escC~eseE操纵子的启动子上，正调控escC~eseE操纵子基因（Ⅲ型分泌系统输送器蛋白及其分子伴侣）的转录。接着，我们探究了输送器蛋白的分泌调控。发现不管是酸性还是中性pH环境条件下，杀鱼爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统调控蛋白EsaB/EsaL/EsaM复合物均对输送器蛋白EseB/EseC/EseD的分泌是必须的。此外，Ⅲ型分泌系统基因簇中EsaE(ORF19蛋白)缺失后，杀鱼爱德华氏菌失去生物被膜形成能力，研究揭示EsaE是T3SS的装置蛋白，通过参与其环状内膜结构的组装影响输送器蛋白EseBCD的分泌，影响生物被膜的形成。本研究的科学意义：病原微生物在体内形成生物被膜介导慢性感染的发生，我们的研究揭示输送器蛋白介导的生物被膜的形成和调控机理，为针对输送器预防爱德华氏菌慢性感染疫苗设计提供了靶标。