microRNAs在断奶应激引发仔猪小肠损伤及重建过程中的作用及调控机制

断奶应激是制约仔猪健康和生长的一个关键因素，一直为生猪养殖中的一大难题。断奶应激主要是影响仔猪小肠的形态、结构和功能，造成小肠组织的损伤和重建。因此，本研究以21日龄仔猪为研究对象，拟采用miRNA芯片技术筛选仔猪在断奶应激过程中差异表达的miRNA，并通过荧光定量PCR进行验证；利用生物信息学结合双报告基因系统，分析、验证差异表达miRNA调控的靶基因；构建过表达或抑制表达miRNA的miR表达载体，经转染仔猪小肠上皮细胞，研究miRNA对仔猪小肠上皮细胞生物学功能的影响。旨在阐明miRNA在断奶应激导致仔猪小肠组织损伤和重建过程中的作用及调控机制，以期为断奶仔猪肠道应激机制研究提供新的思路。

断奶应激主要影响了仔猪小肠的形态和功能，造成小肠组织的损伤和重建。近年来发现miRNAs在应激信号通路和疾病的发生发展中起着重要作用，但在仔猪断奶应激中的作用未见报道。本项目以遭受应激最严重的断奶后1周内仔猪为研究对象，研究了与同日龄哺乳仔猪相比在断奶仔猪肠道中差异表达的miRNAs；分析了差异表达miRNAs调控的靶基因及其功能；验证了miR-215调控的靶基因热休克蛋白90（HSP90）；研究了miR-215对仔猪小肠上皮细胞生物学功能的影响。研究结果：（1）在所有试验仔猪小肠组织共检测到了260个已知miRNAs 前体，占miRBase数据库猪miRNAs 序列的95.94%，几乎覆盖了数据库中所有的猪miRNAs种类；新发现了317个候选miRNAs，其中260个与其他物种的已知miRNAs具有相同的“种子序列”，另有57个可能为猪肠道特异性的miRNAs。（2）在仔猪断奶后1d，4d和7d组分别检测到了16个，98个和22个差异表达的miRNAs，提示仔猪在断奶后4d遭受应激最严重；在所有差异表达的miRNAs中， miR-215呈最大表达丰度且为少数下调miRNAs之一，提示miR-215为主要的核心miRNA，需进行深入研究。（3）荧光定量PCR验证了高通量测序的结果。（4）对所有差异表达的miRNAs进行了靶基因分析，共得到了11572个靶位点，对应3979个靶基因。生物信息学分析结果表明差异表达的miRNAs及其靶基因主要调控了小肠的代谢、应激和免疫功能，提示这些miRNAs很可能在断奶应激致仔猪肠道损伤和重建中发挥了重要作用。（5）以IPEC-J2细胞基因组DNA为模板，成功构建了含HSP90 3′-UTR序列的双荧光素酶报告基因载体。细胞转染48h后，miRNA-215 mimic对HSP90野生型的报告荧光有显著下调作用，报告荧光下降了41％，提示HSP90是miR-215调控的靶基因，miR-215可能通过靶基因HSP90发挥调控作用。（6）利用miRNA-215 mimic和inhibitor转染IPEC-J2细胞后，显著影响了细胞的增殖指数，但未对细胞凋亡率产生显著影响。提示miR-215在仔猪断奶应激过程中可能通过下调表达，促进肠上皮细胞的增殖和重建。本研究为仔猪肠道应激损伤和重建机制研究提供了新的思路和分子治疗靶点。