中间神经元酸敏感离子通道1a在癫痫发生发展中的作用和机制研究

Many researches showed that acid-sensing ion channel (ASIC1a) is mainly expressed in inhibitory interneurons of CNS, and is closely associated with the occurrence of epilepsy. However, the exact cellular and molecular mechanism remains unclear. In herein study, we observe discharging characteristics changes of PV-positive inhibitory interneurons in vivo and vitro on the PV cre-ASIC1a-/-mice temporal epilepsy model, by using EEG, tetrode multi-channel electrode technology and patch clamp recording technique. The expression changes of ASIC1a at the different stages of epilepsy will be explored at cellular and protein levels. Human temporal epileptogenic focus samples will be also studied to verify the results above. This project aims to explore whether ASIC1a regulate the epileptic seizure through mediating the activation of PV-positive inhibitory interneurons and elucidate the molecular mechanism that ASIC1a might develop in the occurrence of epilepsy. In addition, this research will also provide a new insight to develop antiepileptic medicines targeting on acid-sensing channel in treatment of epilepsy.

大量研究表明酸敏感通道ASICla主要表达于中枢抑制性中间神经元，并且与癫痫密切相关，但其在癫痫发生发展过程中的具体细胞分子机制尚不清楚。本课题利用条件性基因敲除PV-ASIC1a-/-小鼠制备颞叶癫痫模型，通过脑电、tetrode多通道电极和全细胞膜片钳技术，从在体（in vivo）和体外（in vitro）两个方面观察PV抑制性中间神经元放电特征，同时从细胞、蛋白等水平观察癫痫发生发展不同阶段ASICla的表达变化；通过上述结果在癫痫患者癫痫灶组织标本中进行印证，以明确ASICla是否通过激活PV阳性中间神经元来调控癫痫发作，从而揭示PV阳性中间神经元上的ASICla参与癫痫的分子机制，为进一步研发ASIC1a为靶点的治疗癫痫药物开拓新的视角。

大量研究表明酸敏感离子通道ASIC1a与癫痫的发生发展密切相关。本课题通过电刺激法及化学药物法成功诱导实现小鼠的癫痫模型。制作tetrode植入式电极并应用在癫痫模型小鼠上，成功记录了在体神经电信号。研究显示相比于对照组小鼠，癫痫模型小鼠在癫痫发作期及发作间期海马CA1区局部场电位（LFP）波段中gamma波及ripple波发放明显增多，其中Spike-wave Ripple（SW-R）在癫痫模型小鼠发作间期的海马CA1中存在特异性发放。通过Offline-Sorter及NeuroExplorer软件对在体电生理数据的深入分析，成功分离出海马CA1区的两种神经元类型：中间神经元及锥体神经元。发现其中中间神经元的发放在癫痫模型小鼠的海马CA1区较对照组小鼠存在显著差异，主要表现在癫痫发放间期中间神经元的发放与SW-R之间存在相位匹配性。项目原计划中涉及的建立PV-ASIC1a-/-老鼠的繁殖系由于该品系老鼠无法顺利获取，该部分研究被放弃。随后，于浙医二院专门购置并安装了膜片钳设备一套，并在此设备上采集并分析了癫痫患者的海马组织标本。利用Western Blotting技术发现癫痫严重程度与ASIC1a表达量之间呈线性关系且ASIC1a表达大多集中在抑制性中间神经元中。通过膜片钳技术对人离体神经元电活动的分析及tetrode多通道电极对小鼠的在体记录的数据分析，发现给予ASIC1a的激动剂后中间神经元的抑制性活动增强，而给予抑制剂则结果相反。而后通过膜片钳对颞叶癫痫患者的颞叶组织进行分析，发现降低脑片人工脑脊液的pH值时可见单位时间内抑制性中间神经元上的自发放动作电位次数增多，提示抑制性活动增强，而在给予特异性ASIC1a通道阻断剂Pctx1后可见抑制性活动减弱。此外通过电流钳模式给予FSI（fast-spiking interneuron）100pA的越阶信号刺激并观察所引发的动作电位频率，发现给予特异性ASIC1a通道剂Pctx1后FSI动作电位频率较前明显下降，上述结果提示ASIC1a参与了抑制性中间神经元神经电活动并借此参与大脑痫样电活动的调控。