禽偏肺病毒mRNA 5’端帽子甲基化修饰介导病毒逃逸宿主先天免疫的分子机制研究

Avian metapneumovirus (aMPV) is an important member of the family paramyxoviridae, causing upper respiratory infection and swollen head syndrome in broilers. Our previous studies showed that the 5' cap structures of aMPV mRNAs had Guanine-N-7 and Ribose 2’-O-methylation, which were catalyzed by Methylatransferases (MTase) locating at conserved region VI in the large (L) polymerase protein. Further, methylation of viral mRNA are essential for viral infectivity and replication. This link between innate immunity sensing of viral RNA and methylation of mRNA suggests that whether RNA modifications play an important role in mediating virus escaping from host innate immune. The mechanism is still unkown. In this study, a series of MTase defective aMPV mutants will be generated and characterized to reveal their biological roles. Flow cytometry and immunological techniques will be used to screen the specific pattern recognition receptors and interferon-stimulated genes that are highly sensitive to the MTase-defective aMPV using the gene knockout cell lines as a mode. This study will provide insights to understand mRNA cap methylation in viral pathogenesis and expand the knowledge of the methylation of negative-sense RNA virus in escaping from host innate immune recognition. Inhibition of mRNA cap MTase can serve as a novel target to rationally design live attenuated vaccines for aMPV, and perhaps other human paramyxoviruses.

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）主要引起禽呼吸道感染和肿头综合征。研究发现其L蛋白第VI保守区编码的甲基转移酶（MTase）能够催化该病毒mRNA 5'端帽子在Guanine-N-7和Ribose 2’-O位点的甲基化，且该修饰对病毒的复制和感染至关重要。甲基化通常作为宿主识别病原的分子标记，那么该病毒的甲基化是否在其逃逸宿主先天免疫方面起了关键作用？分子机制如何？为此，本项目拟采用病毒反向遗传学技术拯救MTase缺陷型aMPV，解析MTase活性区域或关键氨基酸，探明甲基化修饰与病毒毒力的内在关系；以基因缺失细胞系为模型，筛选特异性识别MTase缺陷型aMPV的模式识别受体，阐明mRNA甲基化修饰介导病毒逃逸宿主先天免疫的分子机理。本研究有助于揭示甲基化修饰与自身毒力及免疫逃逸的深层关系，为抗病毒药物和新型疫苗的研发提供新思路。

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）主要引起禽呼吸道感染和肿头综合征。本研究通过分子克隆、荧光标记、反向遗传学等方法，筛选和确定了禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus, aMPV）的加帽和甲基转移酶活关键氨基酸位点，成功拯救了四株aMPV科罗拉多株(Colorado)重组病毒。体外甲基化研究结果显示，四株重组病毒在2’-O位点的甲基化有明显的消减，但在G-N-7位点的甲基化却几乎未受影响。另外，进一步的两步甲基化试验证明G-N-7位点的甲基化先于2’-O位点的甲基化且前者对后者有促进作用。 重组病毒蚀斑试验和生长特性分析表明，四株重组病毒在细胞上培养时高度致弱，且保持着良好的遗传稳定性。人偏肺病毒（human metapneumovirus, hmpv）作为偏肺病毒属的另外一个成员，由于其与aMPV C亚型高达80%的同源性，临床上对引起婴幼儿和老人等免疫力低下人群呼吸道疾病的重要病原体。所以，本研究筛选和确定了hMPV的加帽关键氨基酸位点，hMPV重组株体外生长特性分析及致病性研究表明1141，1254和1317位点氨基酸的突变可以降低病毒的复制能力。此外，本研究还建立了一种快速、高效、准确的用于鉴别不同型aMPV感染的多重荧光定量PCR方法，A、B和C三个亚型的标准曲线R2分别为0.9971/0.9912和0.9957，线性良好。重复性试验结果显示，组内和组间重复性实验的变异系数均低于0.9%，重复性良好。ROC曲线分析，线下面积0.9以上时有较高准确性，本次评估线下面积均大于0.9，具有较好的诊断价值。对比传统PCR方法与该方法进行临床样品检测， Kappa值分别为0.9、0.91和1。综上，缺失2’-O位点甲基化且抑制加帽修饰均可以使病毒的毒力大大致弱且为我们后期研制弱毒活疫苗提供了一个新靶向；建立的多重荧光定量PCR方法，灵敏度高、特异性好，准确度高，可用于临床对aMPV的亚型鉴定及流行病学分析。