毕赤酵母中表达的外源基因分泌特征识别与功能验证

毕赤酵母作为目前应用最为广泛的真核表达系统，研究人员总是希望利用它廉价的高效分泌表达外源基因。到目前为止人们已发现了许多个影响蛋白质分泌的因素，如：信号肽的序列、分子伴侣的数量等。然而，最终实验证明单靠这些因素仍然无法解决一些蛋白质，尤其是那些在天然菌株或细胞内不能分泌蛋白质的分泌问题。随着研究的深入，逐步发现蛋白质自身的序列与结构也是影响该蛋白质是否分泌的一个非常关键的因素。.本研究正是以此为切入点，主要利用模式识别的方法来分析毕赤酵母中分泌蛋白质所特有的分子特征，并利用这些特征设计出识别毕赤酵母中分泌表达蛋白质的分类器。同时还将利用该分类器以及突变体评估工具对蛋白质分子进行重新设计，提高其分泌表达量，并设计分子生物实验来验证结果。该研究旨在阐明毕赤酵母中的分泌表达基因的特征，有效的扩大毕赤酵母表达体系的应用范围，为能更高效地表达分泌蛋白提供理论依据。

毕赤酵母是目前应用最为广泛的真核表达系统，然而并不是所有的基因都能顺利的在该表达系统中表达并且分泌到胞外，本工作主要是研究并发现影响外源蛋白质在毕赤酵母中分泌的其自身的序列与结构，并对这些序列及结构进行设计来提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达的量。.根据该问题首先利用模式识别的方法来分析可在毕赤酵母中分泌的外源蛋白质的分子特征，并利用这些特征设计了专门用来预测外源基因能否在毕赤酵母中分泌表达的软件(Pregensep)。该软件的预测准确率达到95%，MCC系数达到0.79。将该软件应用于8个已在本实验室中通过实验验证其在毕赤酵母中的表达情况的基因，其预测准确率高达75%，表明该软件是一个能够有效预测基因能否在毕赤酵母中表达的工具。利用该软件发现蛋白质除信号肽外的N端序列对外源基因的分泌表达也有很大的影响，通过对这N端的这段序列进行改造，或在N端设计合理的标签序列如来源于大鼠的细胞色素结合结构域蛋白，可以提高外源基因的分泌表达量。该研究部分结果已申请中国专利，专利申请号：201210469485.X。通过分析还发现在毕赤酵母中驻留蛋白质的C端，大部分都有序列KK。通过实验发现这种序列对外源基因的分泌表达有明显的影响，通过对这种序列信息的屏蔽，可以显著的提高外源基因分泌表达的量。另外还发现了蛋白质的稳定性和蛋白质在毕赤酵母中的分泌有明显的相关性，这主要是由于蛋白质在培养上清中的积累是一个分泌与降解相互平衡的结果。通过提高蛋白质的稳定性，可以提高蛋白质的分泌表达量。因此设计了用来预测蛋白质稳定性的软件，如软件Prethermut可以较准确的预测突变对蛋白质热稳定性的影响，该结果已发表于BMC Bioinformatics(2010) 11, 370。通过对蛋白质表面电荷进行优化来提高蛋白质的稳定性。该研究已发表于Biotechnol Lett. 2012;4(6):1115-21。除此之外，我们还发现对影响蛋白质分泌的因素具有可加和性，通过对获得的多种策略进行合理组合，可以大幅度的提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。.通过本研究发现了一些影响外源基因在毕赤酵母中分泌表达的序列因素，通过对蛋白质进行合理设计，可以大幅度的提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量，因此可以有效地扩大毕赤酵母表达体系的应用范围，并为能更高效地表达分泌蛋白提供理论依据。.