α-淀粉酶耐热嗜酸的分子机制及功能改造

Currently, α-amylase (EC3.2.1.1) is the most widely used enzyme in the industry, which can specific hydrolyze α-1,4 glycosidic bond. Nowadays, many industrial applications need the α-amylase with high stability and catalytic activity under high temperature and acidic environment. Many researchers try to improve the stability and the activity under the high temperature and low pH environment by the directed evolution method, but lack of the systematic study on this enzyme. In this study, the various α-amylases with different enzymatic properties isolated from many sources are selected as the study material. The pattern recognition, sequence and structural analysis, molecular simulation, and molecular biology experiments will be used to identify the key molecular features related to the protein stability and catalytic activity in the high temperature and low pH environment. As the result, the whole molecular mechanism which the α-amylase maintains the high stability and catalytic activity under high temperature and acidic environment will be proposed. Based on the identified molecular features, a molecular improvement strategy to the α-amylase will be established and used to design the new α-amylase with more stability and activity than the wild type enzyme under the environment with high temperature and low pH. At last, we will used many molecular experiments to evaluate the designed molecular and obtain the excellent heat-resistant and acidophilic α-amylase. This study will provide in-depth understanding of the enzyme adaption in the high temperature and acidic environment and provide guidance and help on the molecular improvement to the other enzymes.

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是一种特异内切淀粉α-1,4糖苷键的水解酶，是目前用途最广、产量最大的酶制剂产品。耐热嗜酸α-淀粉酶是目前工业应用中迫切最需要的一类淀粉酶。现阶段通常采用定向进化技术对α-淀粉酶进行改良以提高其耐热嗜酸性，然而缺乏对该类酶的系统研究。本研究我们以不同来源不同酶学性质的α-淀粉酶为研究材料，利用模式识别、分子模拟、序列结构分析以及分子生物学实验等方法系统地从进化、序列及结构的角度分析确定与α-淀粉酶在高温和酸性环境下保持稳定及高催化活性相关的结构特征、关键结构模块及氨基酸，并阐明α-淀粉酶在高温和酸性环境下保持稳定及高效催化功能的分子机制。根据确定的α-淀粉酶耐热嗜酸的分子特征，对α-淀粉酶进行全新分子设计，最终通过实验得到酶学性质优良的耐热嗜酸α-淀粉酶。该研究将为深入理解蛋白质的耐热嗜酸性机制以及酶蛋白的分子改良提供指导与帮助。

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是一种特异内切淀粉α-1,4糖苷键的水解酶，是目前用途最广、产量最大的酶制剂产品。耐热嗜酸α-淀粉酶是目前工业应用中迫切最需要的一类淀粉酶。现阶段通常采用定向进化技术对α-淀粉酶进行改良以提高其耐热嗜酸性，然而缺乏对该类酶的系统研究。如何利用机于理性的蛋白质分子设计是针对该酶进行系统改良是α-淀粉酶研究领域中的一个重要方向。本研究我们构建了两个基于计算机模拟的方法来对蛋白质进行理性设计提高其稳定性。其中一个为基于Monte Carlo的蛋白质分子解折叠模拟方法（MCPU）及稳定性相关突变位点的预测方法。该方法可以快速的将蛋白质在不同温度条件下进行蛋白质三维结构解折叠的分子模拟，解析与蛋白质稳定性相关的关键序列然后对其进行理性设计提高其稳定性。另外是一种基于分子动学模拟的方法，通过对蛋白质分子动力学模拟轨迹文件的深度分析，并在此基础上高效设计提高蛋白质稳定性的关键氨基酸。通过利用这些分子设计方法，对不同酶学性质的α-淀粉酶（低温α-淀粉酶中PHA, 中温α-淀粉酶BAA，高温α-淀粉酶BLA，耐热嗜酸α-淀粉酶PFA）进行系统分析，最终发现了一些和α-淀粉酶耐热嗜酸相关的关键位点。如PHA中的位点124、217、255、340及378，BLA中的81，216及268和该酶的稳定性密切相关。另外BLA中的264，72-74等位点与该酶的酸稳定性有关。BLA中的位点390和401与该酶的正确结构形成及其功能性表达有关。通过对这些位点的理性设计或饱和突变，得到了性质优良的α-淀粉酶，有部分位点的突变还能大幅度提高其催化效率，为该酶的理论及应用研究提供了好的试验材料。通过构建α-淀粉酶的高效芽孢杆菌表达系统，以及其基因的优化，最终实现了耐热嗜酸α-淀粉酶PFA在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，其表达量是目前文献报道中最高表达量的9 倍。该研究为该酶的工业化应用奠定了坚实的基础。