酵母二硫键异构酶PDI对毕赤酵母分泌外源淀粉样蛋白的调控机制研究

Previous studies have demonstrated that significant changes in the expression levels of exogenous amyloidogenic proteins in Saccharomyces cerevisiae are correlated with the disruption of Eps1, the homologous protein of Protein Disulfide Isomerase (PDI). Additionally, the altered formation of disulfide bonds within secreted amyloidogenic proteins in Pichia pastoris can hinder the efficient screening of small-molecule inhibitors that can inhibit amyloid aggregation. Our goal is to optimize expression of amyloidogenic proteins in P. pastoris by manipulating expression of the PDI gene, through overexpression or gene knockout. Following expression of model amyloidogenic proteins in genetically modified Pichia, we will use this new system to screen for small molecular compounds capable of inhibiting amyloid formation. Using state-of-the-art RNAseq we will analyze gene expression profiles of different yeast strains [PDI competent and deleted] expressing amyloidogenic proteins. The findings will allow us to identify potential regulatory mechanisms influencing PDI function and how this impacts upon the synthesis and expression of amyloidogenic proteins. In this proposal we plan to apply a combination of computational, genetics, biochemistry, structural and molecular techniques. The implementation of the project will lay the foundation for the construction of a systematic screening platform for small molecule inhibitors of amyloid aggregation.

前期研究发现，在敲除二硫键异构酶PDI同源蛋白Eps1的酿酒酵母中表达外源淀粉样蛋白时表达量出现显著变化；同时，毕赤酵母在表达外源淀粉样蛋白时存在二硫键未正确形成的问题，进而影响对淀粉样蛋白聚集特性以及筛选抗聚集小分子抑制剂的研究。项目拟对已构建的表达淀粉样蛋白的毕赤酵母菌株进行PDI同源蛋白PpPDI编码基因的高表达和敲除，获得分泌淀粉样蛋白前体蛋白的高效表达菌株，并应用于小分子化合物的筛选。运用转录组深度测序技术分析不同菌株之间的基因表达谱差异，调取影响表达状况的关键基因，确定其功能及其作用靶点，总结可能的调控机制，尝试理解PDI影响淀粉样蛋白合成与表达的调控规律。项目在原有的生物学研究方法中将引入分子动力学模拟技术和新型筛选模型。项目的实施将为系统构建抗淀粉样蛋白聚集的小分子抑制物的筛选平台奠定基础。

蛋白质二硫键异构酶（PDI）是一种重要的分子伴侣，能够促进蛋白质在生物体内的折叠并催化蛋白质二硫键的形成。毕赤酵母在表达外源淀粉样蛋白时存在二硫键未正确形成的问题，进而影响对淀粉样蛋白聚集特性以及筛选抗聚集小分子抑制剂的研究。我们构建了表达淀粉样蛋白的毕赤酵母菌株，并在此基础上进行了PDI编码基因的高表达和PDI同源蛋白Mpd1的敲除，发现了三种不同的PDI底物复合物模式，表明PDI与其淀粉样蛋白底物之间的结合可能存在不同的结合方式，获得分泌淀粉样蛋白前体蛋白的高效表达菌株，并应用于小分子化合物的筛选。运用转录组和蛋白质组学技术分析了不同菌株之间的基因表达谱差异，发现PDI可以消减由错误折叠蛋白质滞留胞质空间所产生的溶酶体小体的数量。基于表达外源淀粉样蛋白的酵母菌株平台，我们进行了小分子抑制淀粉样蛋白成纤维阶段和机制的分析，初步确定了小分子干预淀粉样纤维形成的三种模式。项目的实施有助于理解PDI影响淀粉样蛋白合成与表达的调控规律，为系统构建抗淀粉样蛋白聚集的小分子抑制物的筛选平台奠定基础。