少孢节丛菌分泌性纳米粒的生物合成、自装配及转运机制研究

Arthrobotrys oligospora, a representative nematophageous fungus, is a potential source for natural-based organic bionanomaterials due to the presence of specialized 3D adhesive traps that can capture, penetrate and digest free-living nematodes in diverse environments. In 2012, A. oligospora has been discovered to secret the bioactive nanoparticles by our group when it was culutred in a sitting drop culture systen with the low nutrient media (LNM). The fungus-based nanoparticles are polyssacchride-protein conjugates, at least comprising glycosaminoglycans (GAGs), neutral polyssachrides, and two core proteins with respective Mw of ~110kDa and ~80kDa. The nanoparticles have been confirmed to have immunostimulatory and tumor cell killing effects, indicating their potential in biomedical applications. In this study, the chemical stuctures of the fungal nanoparticles will first be elucidated, including the structures of the GAGs, the neutral polyssachrides and the two core proteins, as well as how the three components link together to form the nanoparticles. To understand the biosynthesis of the nanoparticles, the gene squences of two core proteins will be cloned and further labled with green fluorescent protein or monomeric red fluorescent protein (mRFP). Upon doubly labelling the nanoparticles, the next step is to investigate how the NPs are self-assembled and secreted in A. oligospora by using Cofocal microscopy. Based on this observation and coloned gene squences of the two core protiens, the effects of glycosylation site mutation and deletion in the core proteins on the biosyntheses, self-assembly and secretion of the nanoparticels in A. oligospora will be elucidated. With the near endless diversity, understanding how these nature-based nanoparticles are formed in the natural system may provide a template for the synthesis of "next generation" biomimetic nanostructures. More importantly, this proposed study may also open up a new avenue for synthesis of engineered nanoparticles using synthetic biology as technique palform and Arthrobotrys oligospora as a bioreactor in the future.

少孢节丛菌是一种捕食线虫真菌。由于特化三维菌网及其表面大量粘性物质的存在，该真菌被认为是天然有机纳米生物材料的潜在来源。申请人于2012年报道了在低营养液体培养条件下该真菌能产生大量分泌性纳米粒。研究表明该纳米粒是一种多糖与蛋白缀合物，化学组成独特，至少包含糖胺聚糖、中性多糖和2种核心蛋白，具有免疫刺激与抗肿瘤生物活性。为了理解该纳米粒生物合成、自装配与分泌过程，本研究将首先阐明其化学结构，包括糖胺聚糖、中性多糖和2种核心蛋白和他们之间的相互连接关系；通过克隆2个核心蛋白的基因序列，以理解其生物合成过程；经GFP与mRFP标记核心蛋白后，动态分析双荧光标记纳米粒在该真菌内的自装配和分泌过程，以及糖基化位点的突变与缺失对纳米粒生物合成、自装配和转运的影响。天然纳米粒的研究为合成新型结构与生物活性纳米材料提供了多样性仿生模板，并为采用该菌作为生物反应器合成新型的重组型纳米粒奠定理论与技术基础。

少孢节丛菌存在特化三维菌网及其表面的粘性物质，被认为是天然有机纳米生物材料的潜在来源。申请人于2012 年报道了在低营养液体培养条件下该真菌能产生大量分泌性纳米粒。本研究的主要目标在于理解该纳米粒的生物合成、自装配及其细胞分泌过程，研究内容包括以下3个方面： 1）纳米粒的化学分析；2）纳米粒核心蛋白基因克隆、糖基化位点的突变与缺失；3）纳米粒在少孢节丛菌中的自装配与分泌途径示踪。. 经过4年攻关，本项目组如期完成了既定研究目标，取得如下研究结果：. （1）解析了少孢节丛菌分泌性纳米粒的主要蛋白组分，克隆了其基因并探讨了糖基化位点对纳米粒体外自组装的影响：建立了该菌的放大培养体系，大量制备了其分泌性纳米粒。该纳米粒至少包括以下4种蛋白质成分：岩藻糖凝集素g540、氨肽酶g315、植酸酶g232、粘附蛋白g50。进一步克隆其基因并重组表达，分别获得了有功能的4种重组蛋白质；对潜在糖基化位点进行了突变或缺失，发现糖基化并不是影响纳米粒自装配过程的主要因素，而Ca2+及其浓度才是影响该纳米粒自装配的关键因素。. （2）解析了纳米粒在少孢节丛菌细胞内的自装配过程以及动态分泌过程：结合CRISPR-cas9技术，建立了高效的适合该真菌的基因组编辑、原位标记与introbody活细胞示踪研究的技术平台。对上述4种关键蛋白的亚细胞定位研究发现其在细胞壁和3D捕食环细胞表面有大量分布，其基因敲除后显著影响该菌3D环的形成和捕食线虫的活性。利用confocal显微镜和introbody示踪研究技术在液滴培养系统上记录了4种关键蛋白组分在细胞内转运的动态过程，结合亚细胞定位研究结果，初步判断其均可通过ER-Golgi-PVC途径转运并分泌至细胞外，并发现氨肽酶g315是纳米粒形成的最核心成分。. 这些研究结果表明，以少孢节丛菌作为新型生物反应器，利用其优异的蛋白分泌能力，采用先进的活细胞示踪技术，可以动态示踪目标蛋白的生物合成及体内外的自组装过程，这将丰富合成生物学的研究范围，为重组生物功能材料的可控生物合成奠定理论与技术基础。