少孢节丛孢菌侵染线虫分泌性蛋白功能新基因研究

Sheep gastrointestinal nematodiasis is one of animal parasitic disease which is seriously harmful to the sheep industry. The wide use of chemical anthelmintics is still the main means to treat and prevent the disease. However, with the increasing problems such as drug-resistant strains of insects, drug residues in animal foods and environmental pollution, it is urgent to seek a scientific way taking into account the relationship between control of animal diseases and environmental protection. The use of the natural enemies of nematodes-nematode-trapping fungi to prevent and control sheep nematodes is now considered a promising alternative for the biological control of gastrointestinal nematode. In order to truly develop efficient nematicide biological agents, it necessary to explored functional genes ralated to nematode-trapping in molecular mechanisms. On the basis of preliminary studies, representative of the nematode-trapping fungi-Arthrobotrys Xinjiang isolates was studied in the project, and the suppression subtractive hybridization (SSH) technique was used to construct expressed gene cDNA library for screeneing of differentially expressed genes.Then function of the secreted extracellular proteins encoded by differentially expressed genes were analysized using RNA interference, which was futherly to explore the role of the secreted extracellular proteins of Arthrobotrys oligospora. The elucidation of the molecular mechanisms of nematode-trapping will provide a scientific basis for the development of biological agents against gastrointestinal nematodiasis.

绵羊消化道线虫病是严重危害养羊业生产的一类寄生虫疾病，目前使用化学驱虫药是防治该病的主要手段。然而，伴随着耐药虫株的不断产生、动物性食品的药物残留以及环境污染等问题日益凸现，迫切需要寻求一种新的动物疫病-环境友好防控方法。利用线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌来防控绵羊线虫病是一种有应用前景的生物防控方法，然而要想真正研发出高效的杀线虫性生物制剂，必须对食线虫真菌捕食线虫相关功能基因及其作用的分子机制开展深入研究。在前期研究的基础上，本项目拟以捕食线虫性真菌的代表菌-少孢节丛孢菌新疆分离株为研究对象，应用抑制消减杂交技术构建少孢节丛孢菌捕食菌丝形成前、后表达差异基因cDNA文库，用RNA干扰技术对分泌性蛋白差异基因进行功能分析，筛选鉴定出少孢节丛孢菌侵染线虫相关的分泌性蛋白功能新基因，揭示少孢节丛孢菌捕食线虫的分子机制，为绵羊消化道线虫病新型生物防控制剂的研发提供科学依据。

绵羊消化道线虫病是严重危害养羊业生产的一类寄生虫病。利用线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌来防控绵羊线虫病是一种有应用前景的生物防控方法，然而要想真正研发出高效的杀线虫性生物制剂，应对食线虫真菌捕食线虫相关功能基因及其作用的分子机制开展深入研究。项目组以捕食线虫性真菌的代表菌-少孢节丛孢菌为研究对象，应用抑制消减杂交（SSH）技术构建少孢节丛孢菌捕食线虫菌丝形成前、后表达差异基因cDNA文库，用RNA干扰技术对分泌性蛋白差异基因进行功能分析，筛选鉴定出少孢节丛孢菌捕食线虫相关的功能蛋白基因。结果成功构建了少孢节丛孢菌捕食器形成前后的差异表达cDNA文库，筛选得到了9个与捕食相关的差异表达基因，其中包括4个丝氨酸蛋白酶基因（Aoz1、P12、P186、P223）、4个几丁质酶基因（AO-801、AO-483、AO-59、AO-190）和1个粘附蛋白基因（ADP1）。根据差异表达基因测序结果，采用5’-RACE或3’-RACE手段成功扩增到9个完整的差异表达基因，并对其进行了分子特征分析。通过RNA干扰技术证实差异表达基因为捕食线虫相关的功能蛋白基因，其中P186和ADP1基因干扰后对其捕食活性影响最为显著。在毕赤酵母中表达的Aoz1和P186对秀丽杆线虫（C. elegans）和捻转血矛线虫（H. contortus）三期幼虫及虫卵的作用结果证实，重组蛋白酶Aoz1和P186能杀灭C. elegans和H. contortus三期幼虫。纯化的重组蛋白酶reAoz1处理C. elegans和H. contortus 12 h、24 h、36 h后，对C. elegans的杀灭率分别为52%、85%和100%，对H. contortus的杀灭率分别为45%、70%和83%；纯化的重组蛋白酶P186处理C. elegans和H. contortus 12 h、24 h和36 h后，对C.elegans的杀灭率分别为62%、88%和100%；对H.contortus的杀灭率分别为52%、65%和84%；与对照组相比，虫体死亡率差异显著（P<0.05）。研究发现，虫体经重组蛋白酶孵育12 h后被固定，线虫角质层开始被降解；孵育36 h后线虫的体壁和大部分体内组织被降解。本研究完成了任务书中所有研究工作，达到了预期目标，为绵羊消化道线虫病生物防控制剂的研发提供了科学依据。