德国小蠊肠道菌分泌的活性肽抗白僵菌感染的作用机制研究

Entomopathogenic fungus Beauveria bassiana infects German cockroach (Blattella germanica) mainly from the cuticle, intestinal infection is less frequent. Our previous studies have shown that the intestinal flora in German cockroach may inhibit the infection of B. bassiana through the secretion of anti-fungal peptide in vitro, but the mechanism of those intestinal floras inhibiting B. bassiana in vivo is not clear. Based on this, the inhibition ability to B. bassiana of faecal extract gathered from conventional and "axenic"cockroaches will be compared, as well as the susceptibility of cockroach to B.bassiana in vivo. Meanwhile, the anti-fungal peptide in faecal extract are purified and identified with high performance liquid chromatography and mass spectrometry (MS). For further study, the mechanism of the active peptides inhibiting B. bassiana is studied with two dimension difference gel electrophoresis and electronic microscope. The target proteins are verified with immunoblotting and real-time PCR from the protein and transcriptional level; Tandem affinity purification technology (TAP) is used to study the protein interactions of anti-fungi peptides. To investigate the function of the target proteins, RNA interference combining the bioinformatics analysis is adopted. This study will not only contribute to understand the relationship between intestinal flora and the German cockroach and improve the utilization of B. bassiana in the biology control, but also help to obtain bacteria resources with anti-fungi activities from the special environment of the insect gut.

球孢白僵菌主要经体壁感染德国小蠊，经肠道感染很少发生。我们前期发现，德国小蠊肠道菌在体外可分泌抗真菌肽抑制白僵菌生长，但其在虫体内的作用机制尚不清楚。基于此，本课题通过比较“无肠道菌”德国小蠊和正常德国小蠊粪便对白僵菌发芽、菌丝生长以及原生质体的影响，探讨德国小蠊肠道菌对白僵菌的抑制效果；同时，对粪便中的抗真菌活性肽类利用超滤、高效液相色谱、质谱以及核磁共振波谱（NMR）等技术进行纯化和鉴定，并利用电镜结合双向凝胶电泳技术从超微结构及蛋白质组学两方面揭示该活性肽类对白僵菌的抑制机制，对关键靶标蛋白利用免疫印迹和实时荧光定量PCR分别从蛋白和转录水平加以验证；进一步利用串联亲和纯化技术对活性肽的互作蛋白进行研究，对关键蛋白采用RNAi结合生物信息学分析探讨其功能。该研究不仅可探明德国小蠊肠道菌和抗白僵菌感染的关系，还可能找到抗白僵菌等昆虫病原真菌的新分子标记物，为病原真菌的遗传操作提供便利。

德国小蠊（Blattella germanica）是常见的世界性卫生害虫之一，能够携带多种病原体，导致疾病的传播。目前，利用球孢白僵菌和金龟子绿僵菌等昆虫病原真菌开发生物杀虫剂是德国小蠊防治的发展方向。德国小蠊体与其体内的共生菌在长期的协同进化过程中形成了密切的互利共生关系，可以协助德国小蠊提高免疫力并抵抗病原菌的入侵与繁殖。本项目对德国小蠊肠道菌与其抗白僵菌侵染的机理进行深入研究，不仅有利于提高白僵菌制剂对德国小蠊的生防效率，还将为经济动植物病原真菌病药物的研发奠定基础。本实验取得相关结果如下：.肠道共生菌主要以分泌抗真菌活性物质的形式增强虫体对绿僵菌的抵抗能力，且在这个过程中多种中肠肠道菌共同起作用，其中以BGf-2为典型代表；运用划线法从德国小蠊粪便中分离BGf-2菌株，通过生理生化鉴定、16S rRNA核酸检测，将该菌株鉴定为铜绿假单胞菌属；BGF-2菌株及发酵液对球孢白僵菌生长具有明显的抑制作用，20μL菌悬液（1×108CFU/mL）形成抑菌圈直径为31.1±2.0 mm。发酵液处理后白僵菌孢子发芽率为6.8%，形成的抑菌圈直径为35.3±1.0 mm；采用离子交换层析和凝胶过滤层析法，从BGf-2发酵液分离纯化得到抗真菌活性蛋白HY60，经质谱分析、ProtParam、Swiss-model分析，将其鉴定为铜绿假单胞菌假设蛋白，分子式为C2653 H4117 N799 O779 S14；球孢白僵菌的扫描电镜图像显示，BGF-2发酵液和纯化的抗真菌蛋白 HY60对白僵菌生长和产孢均有明显抑制作用，对孢子形态无明显影响。推测白僵菌细胞的死亡可能是由细胞凋亡引起的；采用DOC-TCA 提取法与Label-free蛋白质组学技术提取和分析白僵菌蛋白，发现HY60处理白僵菌后，其菌丝和孢子蛋白质中多数蛋白质的表达量下降，这些蛋白主要涉及蛋白质合成，氧化胁迫反应，细胞呼吸，能量代谢，解毒过程，细胞壁合成等过程。对绿僵菌侵入德国小蠊后免疫基因（AKIRIN，BgPo，CYP5G19，BgChi，BgTPS）的动态变化利用qRT-PCR进行研究，并通过注射双链 RNA 的方法进行RNAi，结果显示免疫基因均出现不同程度的上调或下调，暗示了宿主在感染早期启动了免疫防卫反应，且免疫基因在抵御金龟子绿僵菌感染过程中发挥了重要作用。