与绵羊痘病毒感染相关的宿主microRNA的体外筛选、鉴定及功能研究

miRNAs play crucial roles in viral infection and pathogenesis and are potential targets for disease control. It is now a hot spot to decipher the functions of miRNAs, especially the roles in disease occurrence.The roles of host miRNA-induced silencing network in the infection of poxvirus remains to be established. In this project sheep poxvirus Gansu isolate and miRNAs of sheep ovary cells will be studied. With aid of miRNA target database and combined use of miRNA chip, qPCR, Western blot and Northern blot, host miRNA profiles will be investigate post infection and differentially expressed miRNAs closely related to the viral infection will be screened and identified. The relationship between identified miRNAs and infection of sheep poxvirus will be clarified and illustrated. These results will help us broaden our understanding of pathogenesis of sheep poxvirus, paving a way to develop drugs against sheeppox disease and providing technological platform for other related studies. Moreover, it has scientific and potential application implications.

miRNAs与病毒的感染、致病有密切的联系，发挥重要的功能，可以作为有效控制疾病的靶标。解析miRNAs的生物功能，特别是在疾病发生中的作用是目前研究的热点。宿主miRNA调节网络在痘病毒感染中的作用尚未见实验报道。本项目以绵羊痘病毒甘肃分离株与绵羊睾丸细胞miRNAs为研究对象，借助miRNA靶标数据库与绵羊基因组数据库，采用miRNA芯片、定量PCR、Western blot、Northern blot等分子生物学方法，在体外分析羊痘病毒感染的情况下，宿主细胞miRNA表达谱的动态变化；筛选、鉴定与病毒感染密切相关的差异表达的miRNAs分子；研究这些miRNAs与羊痘病毒感染的相互联系，阐明宿主细胞miRNA在羊痘病毒感染过程中的作用，拓展我们对羊痘病毒致病机理的认识，为研制抗痘病毒药物及其它相关研究提供技术平台和理论支撑。具有一定的科学意义及潜在的应用价值。

miRNAs与病毒的感染、致病有密切的联系，发挥重要的功能。解析miRNA在疾病发生中的作用是目前研究的热点。本项目借助miRNA靶标数据库，采用RNA-Seq、定量PCR等方法，在体外分析了羊痘病毒感染的情况下，宿主细胞miRNA合成途径关键蛋白的表达变化，以及宿主细胞miRNA表达谱的动态变化；筛选、鉴定了与病毒感染密切相关的差异表达的miRNAs分子，并在人工感染的动物体内进行了表达量变化的验证；预测并验证了其靶标分子。结果：羊痘病毒感染LT细胞4h后，细胞中miRNA合成途径中关键蛋白Dicer呈上调趋势，而AGO-2表达无明显改变；有91个差异性表达（p<0.01）的miRNAs，其中48个miRNAs下调，43个miRNAs上调；oav-mir-365-5p，oav-mir-365-3p，oav-mir-34a和oav-mir-455表达差异最大。在羊痘病毒感染0-48h期间，mir-365-5p呈下降趋势，mir-365-3p在0h-10h之间呈上升趋势，10h-48h呈下降趋势。mir-365-3p在发病羊的肝脏、肺脏和瘤胃中呈下降趋势，可作为山羊痘病毒感染候选分子诊断标记。ova-miR-34a-5p在感染0.5 h、4 h和10 h时没有明显变化（P > 0.05），而在感染24h时明显升高（P < 0.05），之后在感染48 h时又有所下降（P > 0.05）；靶基因预测分析发现mir-365-3p靶基因功能主要富集在蛋白质、核酸结合，以及转录调控因子活性，生物学过程主要富集在转录调控和细胞基础代谢过程。而mir-365-5p靶基因功能主要涉及蛋白质结合，生物学过程主要富集于蛋白质代谢过程。mir-365-3p的靶基因信号转导通路富集于细胞骨架调控、趋化因子信号通路、Wnt信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路，而mir-365-5p的靶基因信号转导通路富集于泛素介导的蛋白质降解信号通路和ErbB信号通路。ova-miR-34a-5p的靶标分子的功能主要涉及蛋白质结合，生物学过程主要富集在转录调控、细胞增殖及细胞定位等；荧光素酶报告基因检测结果显示，ova-miR-34a-5p可能通过调节mycn的表达水平影响病毒DNA合成。研究结果为阐明miRNAs分子在羊痘病毒感染过程中发挥的作用奠定了基础，具有一定的科学意义及潜在的应用价值。