绵羊痘病毒140RING finger蛋白的泛素化相关功能的初步研究

Virus can manipulate host ubiquitin-proteasome system to their own benefit, finding inhibitors that block a viral specific ubiquitylation process may be an effective approach for antiviral drug development. It is now a hot spot to decipher the regulation mechanism and interaction between virus and ubiquitin - proteasome system in the process of infection . The interaction between capripoxvirus and host ubiquitin-proteasome system remains to be established. In this project sheeppox virus 140 RING finger protein will be studied. Using vitro ubiquitination detection technology, confocal microscopy, flow cytometry, western blot and other molecular, biochemical methods, the E3 ubiquitin ligase activity of the SPPV140, the subcellular localization of the SPPV140 and conjugated ubiquitin,the regulatory role of ubiquitination and proteasomal degradation of SPPV140 will be investigate. Preliminary explore the ubiquitination related functions of SPPV140. These results will help us broaden our understanding of pathogenesis of sheep poxvirus, paving a way to develop drugs against sheeppox disease and providing technological platform for other related studies. Moreover, it has scientific and potential application implications.

病毒能够操纵宿主的泛素-蛋白酶体系统以利于自身的感染、致病。发现阻止病毒特异的泛素化过程的抑制剂是开发抗病毒药物的一种有效的途径。解析病毒和泛素-蛋白酶体系统在感染过程中的相互作用与调控机制是目前研究的热点之一。羊痘病毒与宿主泛素-蛋白酶体系统的相互作用尚未见实验报道。本项目以绵羊痘病毒（SPPV）140 RING finger蛋白为研究对象，采用体外泛素化检测技术、共聚焦显微技术、流式细胞术、Western blot等分子、生物化学方法，研究SPPV140的E3泛素连接酶活性；SPPV140与结合泛素的亚细胞定位；泛素化和蛋白酶体降解对SPPV140的调控作用。初步探讨SPPV140的泛素化相关功能，拓展对SPPV致病机理的认识，为研制抗痘病毒药物及其它相关研究提供技术平台和理论支撑。具有一定的科学意义及潜在的应用价值。

羊痘是一种急性、热性、接触性的传染病，严重影响畜牧业的健康发展。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定通报的疫病，我国也将其列为Ⅰ类动物疫病。痘病毒等许多病毒可以通过调控宿主的泛素－蛋白酶体系统来逃避宿主的免疫反应，以利于自身的感染、致病。RINGfinger结构域型E3泛素连接酶是泛素－蛋白酶体系统的一个重要的组成部分。羊痘病毒第140号ORF编码一个RINGfinger蛋白，其具有怎样的生物功能，还未见相关报道。. 本研究以绵羊痘病毒甘肃古浪株DNA为模板，PCR扩增绵羊痘病毒RINGfinger蛋白（sheeppox virus RING finger protein，SPPVRFP）基因，并克隆至pEASY-T1载体；采用生物信息学方法对其进行序列分析和结构域预测，并与GenBank收录的不同羊痘病毒株的RINGfinger蛋白基因进行进化关系分析。为了分析SPPVRFP的E3泛素连接酶活性，对影响E3泛素连接酶活性的第181号和第184号半胱氨酸进行突变，构建了突变体重组原核表达质粒pGEX-SPPVRFP（C181S/C184S）和野生型重组原核表达质粒pGEX-SPPVRFP，分别在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，并进行SDS-PAGE和Western-blot分析；对纯化蛋白进行E3泛素连接酶活性检测；为了分析SPPVRFP在羊痘病毒感染细胞中与泛素的共定位，构建野生型重组真核表达质粒pCMV-Flag-SPPVRFP和突变体重组真核表达质粒pCMV-Flag-SPPVRFP（C181S/C184S），转染入绵羊痘病毒感染的羊睾丸细胞，用抗UB和抗Flage标签的二抗孵育，在激光共聚焦显微镜下观察。. 结果表明：SPPVRFP基因大小为723bp，编码240个氨基酸，分子量约为28.5ku，具有RINGfinger结构域；不同羊痘病毒株间RINGfinger蛋白基因核苷酸序列同源性高达99.2％，氨基酸序列同源性高达98.3％，不同的RINGfinger蛋白都含有8个保守的半胱氨酸和组氨酸。SPPVRFP具有E3泛素连接酶活性，且在羊痘病毒感染的过程中，与泛素共定位于细胞质。. 本研究为阐明羊痘病毒和泛素-蛋白酶体系统的相互作用机制奠定了基础。