绵羊胚胎骨骼肌发育相关的microRNA的鉴定及功能研究

MicroRNAs play imoportant role in the regulation of aniaml growth,developmeng and caducity.Although Ovis aries is one of the most important agricultural livestock for meat production ,there is limited information about O. aries miRNAs. It is important to learn the regulation of muscle development for the study on meat production of livestock. Study on ovine embryo microRNA of has not been reported. Here, The miRNA profile from ovine embryo skeletal muscle (E100d，E110d, E130d) are identified by using a deep sequencing approach. New ovine miRNAs will be discovered. miRNAs involved in the skeletal muscle development will be identified. Additionally, analysis on melecular mechanism on target gene of miRNA fuction will be determined.Our reserch will enrich the ovine miRNA database and provided useful information for investigating the biological functions of miRNAs in ovine skeletal muscle development.

微小RNA(microRNA，miRNA)在动物生长、发育、衰老的调控具有重要的作用。绵羊作为一种重要的农业动物，已知的miRNA种类很少，有关绵羊骨骼肌的miRNA表达和功能研究更为匮乏。肌肉生长发育调控研究家畜产肉性状的重要组成部分，尚未见有关绵羊胚胎骨骼肌miRNA的研究报道。本研究首次对绵羊胚胎（70天，100天,130天）骨骼肌的miRNA进行深度测序，构建骨骼肌生长发育的miRNA转录组谱，发掘绵羊新的miRNA，鉴定与绵羊骨胳肌生长发育相关的miRNA ，进一步筛选和验证其靶基因，研究其在骨骼肌发育过程中的生物学功能，以期揭示miRNA调控绵羊胚胎骨骼肌发育的分子机制。本研究可进一步丰富绵羊miRNA数据库，并为动物骨骼肌发育相关miRNA生物功能研究提供依据。

microRNA（miRNA）是一类19-25nt的非编码ＲＮＡ，在生物的生命过程中扮演着十分重要的角色，参与动物生长、发育、疾病等过程。绵羊作为一种重要的农业动物,关于绵羊骨骼肌miRNA及其参与生长发育基因表达调控的研究十分欠缺。本研究通过对绵羊不同发育阶背最长肌的miRNA进行测序，构建其miRNA转录组谱。结合miRNA 测序结果和生物信息学分析，筛选miR-192作为候选miRNA。建立绵羊骨骼肌和C2C12细胞体外成肌分化模型，对miR-192成肌调控作用及其靶基因及进行了研究，阐明miRNA在肌肉生长发育调控的分子机制，并为今后绵羊肌肉发育方面的遗传育种研究提供依据。. 具体研究结果如下：. (1）获得绵羊骨骼肌4个不同发育阶段小RNA表达谱。.完成绵羊了4个不同发育阶段的背最长肌miRNA深度测序。成功获得绵羊胎儿（70日龄、100日龄）、出生后40日龄及成年个体背肌组织小分子RNA，原始小RNA总量达61072341条。在4个不同发育阶段中，21-23nt的小RNA序列是最多的。miR-206、miR-1、mR-3958-3p等在各时期肌肉组织中表达总量较高。.（2）构建了差异显著标的miRNA时空表达谱。.为了验证miRNA 高通量测序结果的准确性，对绵羊小RNA 文库的测序结果中显著差异表达的10 条miRNA 进行了验证。实时荧光定量PCR试验与绵羊小RNA 深度测序结果基本一致。此外，分析部分miRNA在心脏、肝脏、肺脏、脾脏等部位的表达情况。.（3）研究确定mir-192具有调控成肌细胞增殖分化的功能，进一步筛选其靶基因。.成功分离培养绵羊骨骼肌卫星细胞，在体外培养条件下模拟骨骼肌的生长过发育过程研究mi-192对成肌细胞增殖分化的调控作用。发现MiR-192在绵羊骨骼肌卫星细胞和C2C12成肌细胞成肌分化过程中呈现差异表达；研究发现过表达miR-192抑制成肌分化，抑制表达miR-192促进成肌分化。在C2C12成肌细胞中也得到了相似的结果。通过刮伤-愈合试验、alamarblue和流式细胞术检测骨骼肌卫星细胞的增殖情况，证明MiR-192促进绵羊骨骼肌卫星细胞的增殖。应用双荧光素酶方法、western blot、siRNA干扰等方法确定miR-192的靶基因。