灵杆菌合成灵菌红素响应温度调控的分子机制

Prodiginines are a family of tripyrrole red pigments with anticancer, antibacterial, antifungal and antialgal activities. Prodiginines can be produced by Serratia marcescens and other microbes, and its biosynthesis is affected by multiple environmental factors, among which temperature is a key one. However, the molecular mechanism that temperature regulates prodiginine biosynthesis remains unknown. In our previous work, we found that upon temperature shift, the growth of S. marcescens is unaffected, however, prodiginine yield is declined, as well as the remarkable downregulation of the transcription level of prodiginine biosynthetic genes, demonstrating that temperature regulates prodiginine biosynthesis at transcriptional level. This proposal aims to temperature-responding regulators that regulate the transcription of prodiginine biosynthetic genes by DNA affinity capture assay and transposon mutagenesis technique. This investigation will reveal the molecular mechanism that temperature regulates prodiginine synthesis, and provide the theoretical basis for elucidating the regulatory network of prodiginine biosynthesis and obtaining prodiginine high-producing strains by genetic engineering methods.

灵菌红素是一类含有三吡咯环结构的红色素，具有治疗癌症、抗菌、抑藻等多种生物活性。灵菌红素可由灵杆菌等微生物产生，其合成受到多种环境因素的调控，其中温度是决定性因素之一，但温度调控灵菌红素合成的分子机制尚不明确。在前期工作中，我们发现随着培养温度的升高，灵杆菌菌体生长不受影响，但灵菌红素的合成量显著下降，且灵菌红素合成基因的转录水平显著下调，表明温度能够在转录水平上调控灵菌红素的合成。本研究拟通过DNA亲和捕获和构建转座子突变体文库的方法，筛选响应温度变化并调控灵菌红素合成基因转录的调控因子，揭示温度调控灵菌红素合成的分子机制，为完善灵菌红素合成的调控网络和高产基因工程菌株的构建奠定理论基础。

灵杆菌产生的灵菌红素具有抗癌、免疫抑制、抗菌和抑藻等多种生物活性，有着巨大的潜在应用价值。灵菌红素合成酶由灵菌红素合成基因簇编码，但灵菌红素合成的调控机制的研究非常有限，这限制了基因工程在改造灵杆菌获得灵菌红素高产菌株中的应用。本课题主要寻找直接调控灵菌红素合成基因转录的转录因子，揭示灵菌红素合成的调控机制。.本研究首先进行了转座子插入文库构建，利用转座子定位技术找到了2个灵菌红素产量上调的突变株，经鉴定，转座子分别插入到fnr和ohrR基因内部。通过构建fnr和ohrR的缺失突变株，进行摇瓶发酵实验，发现fnr和ohrR缺失后灵菌红素产量上调，表明这两个基因负调控灵菌红素的合成。分别比较野生型菌株与fnr缺失株和ohrR缺失株的灵菌红素合成基因转录水平和蛋白表达水平，发现Fnr和OhrR在转录水平上负调控灵菌红素合成基因的表达。通过EMSA、ChIP-qPCR、DNase I足迹实验、5’-RACE实验等技术揭示Fnr和OhrR是通过直接结合到灵菌红素合成基因启动子区的方式负调控灵菌红素合成基因的转录，进而抑制灵菌红素的合成的。此外，我们还发现有机过氧化物可以通过解除OhrR与灵菌红素合成基因启动子区的结合，解除OhrR对灵菌红素合成基因的抑制，从而激活灵菌红素的合成。本研究中我们还通过优化发酵条件和建立原位萃取发酵工艺，将灵菌红素的产量由0.81 g/L提高到27.65 g/L，并验证来自Serratia marcescens BWL1001的灵菌红素具有较强的抑藻能力。.本项目已正式发表论文4篇，其中SCI论文3篇，申请国家发明专利1项，较好地完成了原定目标。本工作对揭示灵菌红素合成调控机制和利用基因工程手段获得灵菌红素高产菌株提供了理论依据。