LysR家族转录因子LrpG影响温度调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机理研究

Prodigiosin, which has important functions such as antibacterial and antitumor, is mainly synthesized by microorganism in nature. In our previous work, a strain Serratia marcescens JNB5-1, capable of producing prodigiosin effectively was isloated. The prodigiosin production of this strain was regulated by temperature dramatically. S. marcecens JNB5-1 can produce 6.49 g/L prodigiosin at 28°C, while that is only 0.14 g/L at 37°C. The molecular mechanisms how the temperature regulate the Serratia marcescens synthesis of prodigiosin remain unclear. In our previous work, we had identified that LysR family transcriptional regulator LrpG plays an important role in affecting temperature regulation of Serratia marcescens biosynthesis of prodigiosin. In this project, we will combination of comparative transcriptional assay, ChIP-Seq assay, RT-qPCR, fusion reporter gene construction, EMSA and GST Pull-down assay to determine the binding site and signal pathway of LrpG regulates Serratia marcescens production prodigiosin. Combination of lrpG-lacZ fusion reporter gene construction and Tn5G transposon insertion mutation technique to determine the upstream regulatory gene of lrpG controlled by temperature. Based on unravel the molecular mechanism of temperature controlling the Serratia marcescens biosynthesis prodigiosin, we will construct a 37℃ high yield prodigiosin producing strain by systematic metabolic engineering control strategy.

灵菌红素具有抗细菌和抗肿瘤等功能，在自然界主要由微生物合成。本项目组前期筛选得到一株产灵菌红素菌株Serratia marcescens JNB5-1，该菌合成灵菌红素受温度调控，28℃灵菌红素产量为6.49 g/L，37℃仅为0.14 g/L。关于温度调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的机制目前尚不清楚。本项目拟在前期发现LysR家族转录因子LrpG在影响温度调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的重要作用基础上，组合比较转录组学分析、ChIP-Seq、RT-qPCR、融合报告基因构建、EMSA和GST Pull-down assay等技术解析LrpG调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的作用靶点和信号通路。组合lrpG-lacZ融合报告基因构建和Tn5G转座子插入等技术确定lrpG受温度调控上游基因。在解析温度调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机理基础上，利用系统代谢工程策略构建37℃高产灵菌红素粘质沙雷氏菌。

灵菌红素具有抗细菌和抗肿瘤等功能，主要由粘质沙雷氏菌等微生物合成。温度在调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素方面扮演重要作用。本项目以产灵菌红素粘质沙雷氏菌JNB5-1为研究对象，组合比较转录组学分析、RT-qPCR、凝胶阻滞实验EMSA、细菌双杂交实验和Western blot等实验证实，温度调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机理为：双组分调控系统CpxR/CpxA响应温度调控，通过磷酸化激活CpxR的方式，调控灵菌红素合成基因簇pig基因簇的表达水平，进而影响粘质沙雷氏菌合成灵菌红素。此外，较30℃发酵条件相比，灵菌红素及其前体物质编码基因表达水平在37℃显著下调，也是导致菌株在37℃基本不合成灵菌红素的原因所在。在解析温度调控粘质沙雷氏菌合成灵菌红素分子机制的基础上，本项目通过系统代谢工程策略，最终构建得到了37℃可有效合成灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌株。同时，本项目还筛选得到了粘质沙雷氏菌合成灵菌红素新型调控因子RcsB、MetR和PsrA。组合比较转录组学分析、RT-qPCR、融合报告基因的构建和EMSA等实验发现，转录因子RcsB和MetR分别通过负调控灵菌红素合成正调控因子FlhDC和PigP的表达水平调控菌株合成灵菌红素，转录因子PsrA通过直接调控pig基因簇的表达水平调控菌株合成灵菌红素。对转录因子RcsB、MetR和PsrA的功能进行解析发现，RcsB、MetR和PsrA参与调控粘质沙雷氏菌多种细胞进程。. 项目资助期间，相关研究成果发表在Nucleic Acids Res、Sci Adv、Appl Environ Microbiol、Front Microbiol等期刊。申请国家发明专利9项，获授权国家发明专利7项。本项目的实施，为系统代谢工程构建高效合成灵菌红素的粘质沙雷氏菌细胞工厂以及研究其他物种中RcsB、MetR和PsrA蛋白的功能提供了重要借鉴。