灵菌红素缩合酶PigC对底物识别的分子机制研究

作为典型次级代谢产物，灵菌红素及其类似物具有特效的免疫抑制和抗癌活性，其生物合成关键酶PigC表现出混杂的催化功能，在混杂酶催化机理研究、新药开发方面具有重要的研究价值，并对其他次级代谢产物类似物开发具有重要的借鉴作用。而目前关于PigC识别底物机制的深入解析鲜有报道。本课题希望借助于申请者在灵菌红素合成方面所做的初步研究积累，综合运用生物信息学、基因工程及分子酶学等领域的方法及技术，并借助荧光光谱仪、圆二色光谱仪、核磁共振、液质联用等检测手段，建立PigC酶活测定体系及酶促反应动力学模型，确定其活性中心氨基酸组成，考察PigC及其突变体催化不同底物的动力学特征及其酶蛋白结构变化，深入阐释PigC对底物识别的作用机制及催化机理，为酶混杂性预测、酶功能改造及一般酶蛋白的进化提供理论依据；同时为采用组合生物技术高效开发灵菌红素类似物奠定了理论基础。

灵菌红素（Prodigiosin，PG）是一类由微生物次级代谢所产生的天然红色素，PG和它的类似物具有特效的免疫抑制和抗菌、抗癌活性，因此具有广阔的应用前景。灵菌红素缩合酶（PigC）作为灵菌红素生物合成途径中的关键酶，可以催化两个前体物质（2-甲基-3-戊基吡咯(MAP)和4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧甲基乙醛(MBC)）缩合生成灵菌红素。近来发现PigC可利用不同底物合成灵菌红素类似物，因此，PigC在灵菌红素及其类似物生物合成方面具有重要的研究和应用价值。本青年科学项目利用pET原核表达系统对灵菌红素缩合酶PigC进行了克隆表达，并通过镍离子亲和层析法对重组表达的PigC进行了分离纯化；利用自合成的底物，构建了灵菌红素缩合酶PigC的酶活检测体系，实现了利用96孔板和酶标仪的酶活快速检测；利用同源建模的方法，构建了灵菌红素缩合酶PigC氨基端和羧基端的结构模型；为了进一步确认灵菌红素缩合酶PigC的2个主要结构域的作用，在实验过程中，对该酶的两个结构域进行了单独的克隆表达；为了进一步了解灵菌红素的特性及扩大其应用范围，本项目增加了灵菌红素的抑菌机理、灵菌红素的分离提取工艺及灵菌红素染色性能等研究内容，经研究发现灵菌红素通过破坏细胞膜的结构和抑制胞内重要的酶—ATP酶和AKP酶的活性而起抑菌作用的，另外通过中心组合实验设计优化了超声辅助提取灵菌红素的条件，在最佳提取条件下，使灵菌红素的提取率相比于传统的浸提法提高了40%，并研究了灵菌红素作为生态染料对多种化学纤维和天然纤维的染色性能和抗菌性能，经研究发现灵菌红素对多种化学纤维的色牢度均达到4级及以上，抑菌率达到90%以上，基本满足工业化的要求。