Cathepsin D功能抑制在α-synuclein代谢障碍中的作用和机制

α-synuclein(α-syn)异常聚积是帕金森病（PD）的主要病理特征，其修饰、聚积和降解的机制尚未明了。我们前期研究发现PD患者多巴胺能神经元中 cathepsin D(Cts D)表达显著下降，在鱼藤酮PD大鼠模型中也观察到Cts D表达减少并伴α-syn聚积和多巴胺能神经元变性死亡，提示Cts D在α-syn的代谢和多巴胺能神经元的生存中可能扮演重要角色。本课题将在建立PD动物模型和过表达α-syn细胞株的基础上，研究：Cts D对α-syn的降解功能及Cts D功能抑制对α-synuclein的磷酸化修饰和寡聚体形成的作用和机制； Cts D在神经元内的调控机制，从而进一步阐明α-syn聚积的分子机理。本研究围绕PD病理特征的关键角色α-syn，通过对Cts D相关分子事件的研究，提出Cts D功能抑制是α-syn代谢障碍的一个重要原因，为建立新的PD治疗靶点提供理论依据。

帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）的病理特征主要表现为残存神经元胞浆内路易小体(Lewy Body) 形成和黑质纹状体系统多巴胺(DA)能神经元丢失，路易小体的主要成分α-synuclein (α-syn)的过量表达、突变、异常修饰、错误折叠、聚积及降解障碍是多巴胺能神经元变性死亡的主要分子特征，是PD分子机制研究中的重点和难点。本项目主要研究组织蛋白酶Cathepsin D（Cts D）对α-syn的降解作用。我们采用鱼藤酮制备了Lewis大鼠PD模型，利用稳定表达特定基因突变（A30T-α-syn，A53P-α-syn）的PC12细胞株，在体内和体外PD模型中，检测Cts D的表达和酶活性，α-syn的表达状态，发现鱼藤酮作用下，大鼠黑质多巴胺能神经元和PC12细胞中，Cts D从溶酶体漏出至胞浆，酶活性和蛋白表达降低，α-syn聚积体形成增加。在大鼠和PC12细胞中，用VshRNA-Cts D-GFP抑制Cts D基因表达后，α-syn蛋白表达和聚积显著增加。大鼠黑质致密部神经元和PC12细胞内自噬相关蛋白LC3、beclin1，溶酶体相关蛋白Lamp-1，自噬底物p62蛋白表达均增加。CtsD基因抑制的PC12细胞中，给予鱼藤酮干预， LC3、beclin1等表达显著低于单纯鱼藤酮干预组。鱼藤酮作用下，多巴胺能神经细胞溶酶体内另一种组织蛋白酶cathepsin L被异常激活，同时采用cathepsin L抑制剂Z-FF-FMK处理PC12细胞，发现Cts D的表达较鱼藤酮单独处理组显著提高。实验结果表明， Cts D酶活性降低和蛋白表达减少是导致α-syn蛋白聚积的原因之一，与Cts D酶活性降低和功能抑制直接减少了对α-syn蛋白的清除有关，同时由于Cts D的功能抑制可能降低环境毒素条件下细胞的自噬激活，使自噬流遭到破坏，导致α-syn的另一降解途径——自噬-溶酶体通路障碍，加剧其神经毒性。此外，Cathepsin L异常激活可能与Cts D的蛋白表达降低有关，参与Cts D的分子调控。综合以上研究结果，我们认为Cts D的功能抑制可能是α-syn代谢障碍的重要分子机制之一。通过调节神经细胞内Cts D的表达水平，维持其酶活性和蛋白降解功能，促进其对α-syn聚积体的清除，发挥神经保护作用，可望为帕金森病的治疗开拓新思路。