c-Abl调控U2AF65介导的mRNA剪接及核质转运机制研究

RNA成熟加工是真核生物基因表达调控中的重要环节，mRNA剪接则直接影响了相应基因的编码信息。pre-mRNA剪接由巨大的剪接体完成。剪接体由5种细胞核糖核蛋白小体和100多种非snRNP蛋白组成。U2AF是U2 snRNP结合到pre-mRNA分支位点所必需的辅助因子，它由U2AF65和U2AF35两个亚基组成.U2AF65是参与mRNA剪接及mRNA核质转运的必需因子.c-Abl是重要的Src家族非受体酪氨酸激酶,具有多种生物功能。目前有报导c-Abl还能够调节mRNA剪接相关因子。我们的研究发现c-Abl可以与U2AF65的UHM结构域结合并使其磷酸化，当细胞受到电离辐射处理后，U2AF65的核质间转移是c-Abl依赖的。本课题将系统研究c-Abl酪氨酸激酶与U2AF65的相互作用，研究c-Abl介导的U2AF65磷酸化，并阐释其调控mRNA剪接、mRNA核质转运的分子机制。

本项目系统研究了非受体酪氨酸激酶c-Abl与剪接因子U2AF65相互作用，c-Abl 介导U2AF65磷酸化，c-Abl调节U2AF65的核质穿梭和mRNA转运的机制，c-Abl参与调控转录和前体mRNA可变剪接以及其通过U2AF65介导的剪接调控的机制。项目研究总体按照既定的实施计划，稍作调整和变动，取得了预期的研究结果。. 项目研究得到如下关键结果：证明c-Abl和U2AF65在细胞内外直接相互作用，并且c-Abl通过SH2、SH3结构域与U2AF65直接结合。发现U2AF65与c-Abl结合的结构域是UHM结构域，参与结合的氨基酸残基主要包括第414、416和423位脯氨酸。证明c-Abl使U2AF65酪氨酸发生磷酸化，但是磷酸化程度较弱；质谱分析发现其可能的磷酸化位点是第91位和第232位酪氨酸。进一步发现c-Abl基本不影响U2AF65的表达。U2AF65是核质穿梭蛋白，但通常在荧光显微镜下只在细胞核中被观察到。发现在电离辐射导致的DNA损伤应激条件下，U2AF65由细胞核向细胞质转移，转移程度具有剂量依赖性；随着时间的推移，U2AF65又由细胞质向细胞核转位。以c-Abl特异性抑制剂STI571处理细胞，无论是出核还是之后的入核都被抑制。在缺失c-Abl激酶活性的MCF-7细胞系中发现U2AF65更多地定位在细胞质，以15Gy剂量的电离辐射处理之后，也没有发生核质间转移，说明U2AF65在细胞内的分布和c-Abl的活性相关。由此证明c-Abl调控电离辐射介导的U2AF65的核质间的穿梭。实验证明U2AF65蛋白自身可能含有NES信号。之后分析发现U2AF65可能的NES的特征性序列LCLMNMVLP。通过瞬间异核体形成实验证明U2AF65的NES介导其出核。同时发现，电离辐射可调控U2AF65介导的mRNA转运，在细胞接受电离辐射不同时间后，细胞质中U2AF65介导的HEXIM和ZNF174基因mRNA水平均升高。通过Affymetrix外显子芯片和RNA-Seq分析发现c-Abl广泛参与的转录和剪接调控，U2AF65参与剪接调控。尤其是电离辐射诱导的DNA损伤修复通路的剪接调控。部分数据得到RT-PCR实验验证。. 本项目的原创性研究对深入认识c-Abl在生理和应激条件下的基因转录、mRNA前体剪接、出核转运等调控功能具有重要意义。