转染dThdPase基因联合巨噬细胞因子靶向治疗结直肠癌

5'-DFUR是5-FU的前体药物，在癌细胞内被胸苷磷酸化酶（TP）激活，转变为5-FU后发挥抗癌作用，而对不表达TP的正常细胞无毒性，因此癌细胞表达高度活性的TP是治疗的前提。但我们在前期研究中发现，结直肠癌组织中癌细胞几乎无TP表达，表达TP的细胞主要是癌巢周围的巨噬细胞。在体外巨噬细胞因子INF-γ可以增强结肠癌细胞对5'-DFUR的敏感性，INF-α则可以增加癌细胞TP的mRNA表达。但在体内动物实验尚未得到证实。本研究尝试通过给结肠癌细胞转染TP基因使癌细胞产生TP蛋白，并联用巨噬细胞因子上调细胞内外TP活性而增强5'-DFUR的抗癌活性，进一步用此转染癌细胞制作结直肠癌实验动物模型，分组应用5-FU、5-DFUR、5'-DFUR+巨噬细胞因子进行治疗干预，探索自杀基因转染联合巨噬细胞因子增强5'-DFUR靶向治疗结直肠癌的新途径。

5’-脱氧氟脲苷（5’-DFUR）是5-FU的前体药物，在肿瘤细胞内被胸苷磷酸化酶(TP)激活，转变为具有抗肿瘤活性的5-FU，而对不表达TP的正常细胞没有杀伤作用，因此肿瘤细胞表达高度活性的TP是这类药物治疗的关键。但我们的前期研究发现，结直肠癌组织中癌细胞并不表达TP活性，表达TP活性的都是肿瘤细胞周围的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。在体外巨噬细胞因子INF-γ可以通过上调TP的mRNA表达增强结肠癌细胞对5’-DFUR的敏感性，但尚未得到体内实验的证实。本研究中我们利用慢病毒作为载体，将TP cDNA转染到结肠癌细胞株LOVO, SW480，HT29， LS174T中，经过传代培养5代后仍能保持95%以上的转染效率。RT-PCR检查发现转染TP基因后，该4株细胞的TP mRNA表达明显提高了8.45倍~2615倍，Western blot证实4株细胞的TP蛋白表达也明显增强。通过对转染TP基因前后的4株结肠癌细胞株分组进行5-FU和5’-DFUR的细胞毒性试验发现，转染TP基因后，5’-DFUR对4株结肠癌细胞的半数有效剂量（IC50）明显降低，最低可降低到仅相当于转染前的0.2%（LS174T）。应用高效液相色谱(HPLC)检测发现，4株结肠癌细胞和5’-DFUR一起培养过夜后在培养基中仅有很少的5-FU检出，但在转染TP基因后，检出的5-FU明显增多，最多可达到原来的28.7倍（HT29）。进一步应用干扰素-α(INF-α)处理后，转染TP基因的LOVO细胞的培养基中检出的5-FU含量进一步增多，为野生型细胞的2.9倍，单纯转染基因（未用INF-α处理）的1.4倍。但以上结果在裸鼠动物实验中未得到证实。结论：慢病毒载体转染TP基因在体外可以明显提高结肠癌细胞TP的mRNA和蛋白表达，增强5-FU前体药物5’-DFUR在癌细胞周围转化为5-FU能力，提高该药物靶向治疗作用。细胞因子INF-F-α可以进一步增强转染TP基因后的结肠癌细胞的TP表达和提高5’-DFUR对该细胞的抑制作用。