乳源性抗氧化肽对过氧化氢诱导的细胞氧化应激的调控机制

自由基代谢失衡，会引发机体的氧化应激。抗氧化肽的摄入是重建机体氧化/抗氧化平衡的重要途径。本项目以过氧化氢为诱导剂，构建PC12细胞氧化损伤模型，用乳源性抗氧化肽（APMP）进行模型干预，通过细胞存活率、双标记流式细胞术细胞凋亡检测和扫描/透射电镜细胞形态学观察，分析其对损伤的保护作用；采用荧光探针、免疫组化染色、ELISA法等研究APMP对细胞膜和线粒体膜功能、总抗氧化能力和脂质过氧化的调控；采用RT-PCR、蛋白质免疫印迹和激光共聚焦显微技术，研究APMP对内源性抗氧化酶/蛋白体系的保护作用，分析其对细胞凋亡通道的调控作用，包括对凋亡途径中涉及到的信号蛋白、凋亡因子的基因转录水平、蛋白表达水平、在细胞内分布、迁移和降解状况的影响。本项目研究有助于揭示APMP对氧化损伤细胞的生物学效应，完善抗氧化肽的应激调控机制，为食源性抗氧化肽及生物活性物质的研究和应用提供方法学借鉴和理论指导。

自由基代谢失衡，会引发机体的氧化应激。抗氧化肽的摄入是重建机体氧化/抗氧化平衡的重要途径。本项目以乳清蛋白为原料，以水解度及DPPH自由基清除率为考察指标，确定了酶解最适条件为：Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，底物浓度为45 mg/mL，[E]/[S]＝2%(w/w)，温度65℃，pH 8.5，水解时间2 h。对酶解产物(WPHs)进行了分级、纯化以及结构分析，在得到的7种乳清蛋白抗氧化肽中WYSL的抗氧化能力最强。肽段的量子化学计算结果与抗氧化活性大小的一致性表明：前线轨道能级差与短肽的抗氧化活性相关，WYSL分子中自由基反应的活性为吲哚环上的N9-H49，吲哚环上各原子之间的二面角非常小，电荷流动性强，利于脱氢反应的进行。..以H2O2为诱导剂，构建了PC12 细胞氧化损伤模型。用WPHs进行模型干预，通过细胞存活率、细胞形态、细胞凋亡的定性和定量分析，探讨了WPHs对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激的抑制作用。结果表明100-400μg/mL浓度的WPHs对H2O2诱导引起的氧化损伤有明显的保护作用，200μg/mL的WPHs对损伤细胞的状态有明显改善作用。此外，WPHs的不同洗脱级分，随疏水性的提高，其保护作用呈现出增强的趋势。..采用试剂盒检测、流式细胞术、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹等方法，研究了WPHs 对内源性抗氧化酶的保护作用和对细胞内活性氧、Ca2+的浓度和线粒体膜电位的影响。分析了其对细胞凋亡通道的调控作用，主要包括对细胞凋亡途径中相关蛋白表达水平的调控和细胞凋亡相关酶的表达。200μg/mL WPHs对PC12细胞抗氧化酶系统有明显的提高，可以抑制细胞内活性氧的聚集，稳定胞内Ca2+的浓度，阻止细胞线粒体膜电位的崩溃，抑制H2O2促发的凋亡关键酶Caspase3酶的激活，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax蛋白的表达，以及阻止DNA修复酶pro-PARP的剪切，减少细胞凋亡的发生。WPHs的不同级分有相同的作用，并呈现出M60>M40>M20的趋势，推测是样品的疏水性对这种趋势做出了重要贡献。..本项目有助于揭示乳源性抗氧化肽对氧化损伤细胞的生物学效应，并对WPHs本身的性质与抗氧化活性的关联进行了探讨，进一步解释了抗氧化肽的应激调控机制，为食源性抗氧化肽的研究和应用提供方法学借鉴和理论指导。