麦胚抗氧化肽对细胞氧化应激的调控机制及其构效关系

拟以H2O2为诱导剂、SH-SY5Y细胞为载体建立细胞氧化损伤模型，用麦胚抗氧化肽干预H2O2对细胞的氧化作用，通过检测细胞内活性氧水平，分析细胞膜及线粒体膜、各类凋亡因子和信号蛋白、抗氧化酶系的变化等手段来探索麦胚抗氧化肽以何种方式对H2O2引起的细胞凋亡进行抑制、以何种细胞信号通路保护细胞免受/减弱外源自由基引起的氧化损伤，从细胞水平阐明麦胚抗氧化肽对细胞氧化应激的调控机制。拟利用Gaussian 03软件计算获知的系列麦胚抗氧化肽的结构参数从理论上推测抗氧化肽活性位点，并通过丙氨酸扫描、掩蔽活性位点或酶解脱去活性位点等方法验证所推测活性位点的正确与否；综合抗氧化肽保守序列推测、肽链内氨基酸间短程相互作用、活性位点推测与验证探讨麦胚抗氧化肽的构效关系，阐明麦胚抗氧化肽的抗氧化机理。以期为麦胚抗氧化肽的功能应用提供生物学依据、人工合成或改造抗氧化肽提供结构信息。

抗氧化肽是一类天然且安全的自由基清除剂，但目前对抗氧化肽的活性机制及构效关系的研究大多浅表地停留在体外评价其是否具有清除自由基能力的层面或直接采用动物实验法进行评价，还不清楚在细胞与生物体内作用机理及构效关系。本项目采用H2O2诱导的细胞氧化损伤模型，从细胞内活性氧水平、抗氧化酶活力、小分子抗氧化剂谷胱甘肽含量以及脂质、蛋白质损伤和细胞线粒体、NF-κB凋亡通路的调控等方面，深入地研究了麦胚肽RVF对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的抗氧化机制；并以天然氨基酸为研究对象，采用F/6-31g(d)、B3LYP/6-31、B3LYP/6-311+G (d,p)3类不同基组/方法计算了与抗氧化活性相关的20种氨基酸的结构/能量参数，包括键长、电荷、轨道能量、BDE值、AIP值、EA值与ETE值等，根据计算得到的结构参数进行抗氧化活性的QSAR模型构建；采用DFT/B3LYP6-31方法/基组计算了11条食源性抗氧化肽的结构参数，据结构参数构建了抗氧化活性QSAR模型，并据所建QSAR模型预测了本研究所设计的20条肽序的抗氧化活性。结果表明：麦胚抗氧化肽RVF可通过减少H2O2诱导的O2−•的生成，提升超氧化物歧化酶的活力和还原型谷胱甘肽的含量，并降低脂质、蛋白质羰基化水平和DNA损伤；通过抑制NF-κB通路的激活，减少p53蛋白及下游线粒体凋亡通路Bax蛋白的表达，进一步降低线粒体凋亡通路下游Caspase-3,9蛋白的剪切以及提升XIAP蛋白mRNA水平的表达，从而调控线粒体通路细胞凋亡；并通过提升细胞凋亡死亡受体通路中cFLIP蛋白在 mRNA水平的表达以及抑制Caspase-8蛋白的剪切活化，从而调控死亡受体诱导的细胞凋亡。本研究建立的氨基酸和抗氧化肽清除O2-·的QSAR模型线性关系良好（其R2值分别为0.865和0.884），而清除·OH的QSAR模型不能很好地预测抗氧化肽清除·OH的能力；用于模型验证的合成肽清除O2-·的Log IC50的预测值与实测值的误差皆在30%以内，表明所构建的食源性抗氧化肽QSAR模型可很好地指导抗氧化活性肽的设计和筛选。本项目从细胞分子生物学层面阐明了麦胚抗氧化肽RVF对SH-SY5Y细胞氧化应激的调控机制，基于量子化学的抗氧化肽QSAR模型的建立及其构效关系研究则为人工合成或改造抗氧化肽提供了结构信息和理论指导。