ClC-3对过氧化氢诱导的脑基底动脉平滑肌细胞线粒体自噬的调控及机制

We previously found that suppression of ClC-3 ameliorated cerebrovascular remodeling during hypertension.Although it has beem suggested prevention of vascular remodeling was related to functional roles of ClC-3 on mitochodrial apoptosis,the molecular mechansims of ClC-3 regulating hypertensive vascular remodeling remained to be defined. Recent growing evidence supported the idea that autophagy are critical in vascular remodeling，acting as an important adaptive mechanism to oxidative stress. Our preliminary experiments found that in basilar artery from Doca salt mice, the expression of ClC-3 was increased, acompanied by a higher level of cell autophagy indicated by a higher expression of LC3-Ⅱ and a lower expression of p62 protein compared with that from sham operated mice.Furthermore,coimmunoprecipitation experiments revealed a physical association between ClC-3 and VDAC,a protein in mitochodria membrane which played important roles on mitophagy.Knockout of ClC-3 decreased cell autophagy induced by hydrogen peroxide,and reduced cell viability of basilar artery smooth muscle cells.Based on the results above,the research here was to explore the physiologic function of ClC-3 in regulation of mitophagy both in basilar artery smooth muscle cell level and in a Doca salt mice model.Our study would demonstrated that regulation of mitophagy by ClC-3 served as an adaptive homeostatic mechanism during hypertensive vascular remodeling.

我们前期研究发现抑制ClC-3可改善高血压脑血管重构,其影响重构的机制尚未完全清楚,可能与ClC-3通过线粒体通路保护细胞凋亡有关。近有研究提示自噬在血管重构中有重要作用,自噬是氧化应激下细胞保护凋亡的适应机制。我们预实验发现，在高血压小鼠脑基底动脉，ClC-3表达升高,细胞自噬增加；进一步研究发现,ClC-3可与线粒体膜上对自噬有重要作用的蛋白VDAC免疫共沉淀,且敲除ClC-3可以减弱过氧化氢诱导的脑基底动脉平滑肌细胞自噬，降低细胞存活率。在前期研究和预实验的基础上，本项目拟在细胞水平研究ClC-3对过氧化氢诱导的线粒体自噬的调控及机制，并在整体动物水平探讨ClC-3敲除对脑基底动脉平滑肌线粒体自噬和血管重构的影响，为将来通过调控ClC-3来干预高血压脑血管重构提供实验依据。

脑卒中是最常见的脑血管疾病之一。脑卒中一个重要的病理改变是脑血管重构。高血压脑血管重构的机理尚不明确,研究提示其与VSMCs增殖与凋亡失衡有关；我们前期研究发现抑制ClC-3可改善高血压脑血管重构,其影响重构的机制尚未完全清楚,可能与ClC-3通过线粒体通路保护细胞凋亡有关。传统生物医学概念中，线粒体主要功能是作为生产ATP的“能量工厂”。现代研究发现，在并不需要大量能量的血管组织，线粒体可作为信号的感受器（signaling sensors），信息的集结部（signaling hubs），在调节增殖，自噬，凋亡，坏死等重要的生理病理过程。. 有研究发现，ClC-3敲除鼠大脑海马出现退行性缺如和学习记忆障碍，其机制尚不清楚，可能与ClC-3敲除引起自噬功能失调致神经元的变性退化有关。近年有研究表明血管平滑肌细胞自噬可能在血管重构中发挥重要作用。自噬对细胞凋亡的调节参与了VSMCs和一型胶原的丢失过程，对血管重构和动脉粥样硬化斑块的稳定性有重要影响。近有研究报道，骨桥蛋白通过integrin/CD44和p38 MAPK信号途径对血管平滑肌细胞自噬的调节参与了腹主动脉瘤的发展过程。. 本项目首先建立大鼠脑基底动脉平滑肌细胞自噬模型，发现100μMH2O2可以成功诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞自噬；并且发现100μM H2O2 诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞自噬过程中，ClC-3表达增加；敲除ClC-3可以减弱H2O2诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞自噬；电镜免疫胶体金实验发现ClC-3在线粒体膜上有表达, 敲除ClC-3可以减弱H2O2诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞线粒体自噬, 免疫共沉淀实验发现ClC-3与线粒体膜蛋白VDAC存在相互作用; ClC-3敲除抑制Akt 473位丝胺酸的磷酸化,可以增加细胞色素Ｃ的释放，capspase-9/caspase-3的活化，降低线粒体膜电位的稳定性和BCL-2/Bax的比值；抑制ClC-3可通过线粒体依赖的凋亡信号加重血管平滑肌细胞凋亡；最后，我们在动物整体水平证实，敲除ClC-3可以明显降低高血压小鼠脑基底动脉自噬，改善高血压小鼠脑基底动脉重构。本项目为将来通过调控ClC-3来干预高血压脑血管重构提供了新的实验依据。