53BP1与E1F1相互作用的分子机制及功能研究

p53结合蛋白（53BP1）是一种DNA双链断裂修复的感受/效应分子，维持基因组稳定性。E2F1是一种转录因子，可正、负性调节细胞生长，也是一种重要的DNA损伤修复信号通路的调控分子。研究证明，拓扑异构酶结合蛋白I可通过BRCT结构域结合E2F1。鉴于53BP1含有BRCT、Tudor结构域，所以我们提出假说：53BP1可通过这些结构域结合E2F1；通过这种相互作用，53BP1负性调节E2F1转录因子活性，抑制细胞周期调节蛋白表达，阻止细胞周期进程；二者共同被招募到坍塌的复制叉，阻止DNA复制，促进DNA损伤修复，维持基因组稳定性。本项目拟以正常和肿瘤细胞系为对象，采用分子细胞生物学原理与技术，研究53BP1-E2F1相互作用及其分子机制，探索DNA损伤应激条件下这种相互作用的生物学功能，验证假说，提出53BP1、E2F1在DNA损伤修复、细胞检验点信号调节中发挥作用的新功能、新模式。

本项目通过抑癌基因p53(TP53)结合蛋白1——53BP1与E2F1相互作用及其对E2F1功能的调节，探索53BP1、E2F1在DNA损伤应激中的新功能。53BP1、E2F1表达动力学分析揭示，DNA损伤可刺激E2F1蛋白表达上调，但53BP1表达却没有变化，而是发生了核转位。GST Pull-down证明，53BP1与E2F1可发生（体外）相互作用，采用CoIP偶尔检测到53BP1-E2F1相互作用（即偶现重复性），但采用颜色共定位（color co-localization）检测到DNA损伤时有E2F1核仁转位，但53BP1主要分布在核质。上述结果提示，DNA损伤时53BP1与E2F1分布在不同的细胞区间。鉴于此，以及TP53与53BP1一样均为E2F1相互作用蛋白，我们在2010年《进展》报告中修正了年度计划，增加了DNA损伤时E2F1与TP53等相关蛋白的相互作用及其对E2F1转录功能的影响。主要发现和结果如下。.（1）TP53与E2F1相互作用、形成p53-E2F-PLK1启动子复合物，抑制PLK1基因激活：既往研究证明p53、E2F1通过相互作用可抑制对方DNA结合活性，抑制彼此的转录。但我们发现p53通过p53-E2F--DNA复合物抑制E2F1依赖的PLK1基因转录激活，为p53调节E2F1在细胞周期中的功能及p53介导的G2/M阻滞提出了新的解释。相关工作已经总结、投送《核酸研究》。.（2）p14ARF与E2F1相互作用、形成p14ARF-E2F/partner-DNA复合物，抑制E2F1靶基因激活：ARF通过与E2F1相互作用，形成p14ARF-E2F/partner-DNA超（级）复合物，抑制包括ARF在内的E2F1靶基因转录。这样，ARF抑制E2F1转录与E2F1激活ARF两个相对的基因表达通路共同组成反馈环路，协调调节细胞增殖和凋亡。相关工作已经发表。.（3）DNA损伤引起E2F1核转位依赖ATM。（4）DNA损伤引起Cdc4B-CDH1-SKP2介导的E2F1失调引起中心体扩增及多倍体发生。.本项目已发表项目批准号标注SCI论文4篇，已投稿1篇，投稿中2篇；培养博士生3名，硕士生1名。