DnaK伴侣系统对酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热特性的调控作用研究

Alicyclobacillus acidoterrestris is a genus of acidophilic and thermophilic resistant bacteria with the ability to survive traditional pasteurization process under the acid condition, it has proved that the DnaK Chaperone System closely related with the stress resistance of organisms, therefore, to investigate the regulating function of DnaK chaperone system on the thermo-acidophilic resistance of Alicyclobacillus acidoterrestris is of great significance for hazard control and utilization of this bacterium. Based on our previous results of mRNA expression of genes in DnaK chaperone system, Western-Blot electrophoresis will be used to assay protein expression differences of DnaK chaperone system of A.acidoterrestris under heat and acid stress conditions and further determine the functions of DnaK chaperone system of A.acidoterrestris responding the heat and acid stress; gene knockout and retro-complementation of DnaK chaperone system in A.acidoterrestris will be performed to analyze the synergistic regulation of DnaK chaperone genes on thermo-acidophilic resistance of A .acidoterrestris; and heterologous gene expression experiment will be used to evaluate the effects of DnaK chaperone system of A.acidoterrestris on the heat and acid tolerance of E. Coli.; which aim at exploring the regulation mechanism of DnaK chaperone system on the thermo-acidophilic resistance of A.acidoterrestris and provide theoretical and experimental basis for the rational development and utilization of A. acidoterrestris.

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的双重生理特性，能经受酸性条件下的巴氏杀菌过程而存活，DnaK伴侣系统与微生物抗胁迫能力密切相关，进行DnaK伴侣系统对酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热特性的调控作用研究对该菌的危害控制和开发利用等具有重要意义。本课题基于DnaK伴侣系统基因mRNA表达水平的研究结果，拟利用Western-Blot技术检测酸、热逆境下酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK伴侣系统蛋白表达差异，从蛋白质水平探讨DnaK伴侣系统在该菌响应酸、热胁迫应激过程中的功能；通过酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK伴侣系统基因敲除、基因回补实验，研究DnaK伴侣系统基因协同调控酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热特性的作用；通过异源表达实验研究酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK伴侣系统对大肠杆菌抗酸热胁迫能力的影响；以期从分子水平上揭示DnaK伴侣系统对酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热特性的调控机理，为该菌的合理开发利用提供理论和实验依据。

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的双重生理特性，是引起酸性果汁腐败变质的主要菌种，如何降低控制其危害并有效利用该菌是食品研究领域普遍关注的问题。DnaK伴侣系统对多种微生物的抗逆能力有调控作用，推测该系统与酸土脂环酸芽孢杆菌的嗜酸耐热特性有关。本研究从分子水平上对酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK伴侣系统响应酸、热胁迫的表达规律进行探索，并通过基因敲除及在大肠杆菌中的异源表达研究DnaK伴侣系统对该菌嗜酸耐热特性的调控作用。主要研究结果如下：.（1）利用western blot技术分析了DnaK蛋白在不同温度和pH条件下的表达差异，发现其在正常生长条件下组成型表达，在热、酸胁迫下表达量在短时间内迅速上调，明确了DnaK伴侣系统蛋白在酸土脂环酸芽孢杆菌抗酸、热逆境应答中的变化规律。.（2）优化了酸土脂环酸芽孢杆菌感受态细胞制备方法，筛选适合酸土脂环酸芽孢杆菌的复制型质粒，探索电击转化酸土脂环酸芽孢杆菌的条件及多种革兰氏阳性细菌基因敲除方法对酸土脂环酸芽孢杆菌基因重组效率的影响，建立了适用于酸土脂环酸芽孢杆菌基因敲除的方法和系统，获取了DnaK伴侣系统基因缺失的突变菌株。突变菌株的生理特性分析及耐酸、热胁迫能力试验表明DnaK伴侣蛋白与酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热的双重生理特性密切相关。.（3）对表达酸土脂环酸芽孢杆菌DnaK基因的重组大肠杆菌和野生大肠杆菌分别进行酸、热胁迫处理，并对重组大肠杆菌在不同温度和pH组合胁迫下的存活率进行检测。结果表明在不同组合处理下，重组大肠杆菌的D值比野生大肠杆菌高14.7-72%，其耐热性和耐酸性均明显高于对照组，表明DnaK基因在大肠杆菌中的异源表达显著提高了宿主菌的耐酸、热胁迫抗性。 .本研究结果揭示了DnaK伴侣系统调控酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热独特生理特性的分子机理，为全面解析该菌嗜酸耐热机理奠定了基础，但酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热特性的分子调控机制尚不清楚。酸土脂环酸芽孢杆菌响应酸热胁迫的关键蛋白调控网络及其在应激过程中的相互作用需要进一步研究。