先天性巨结肠患者SEMA3C/D基因功能失活突变影响肠神经系统发育的细胞和分子机制

Hirschsprung disease (HSCR) is the most frequent cause of functional intestinal obstruction in children and is a congenital neuro-developmental disorder implicating the enteric nervous system (ENS). Cumulatively, mutations detected in 11 genes to date can only explain a minority (5%) of cases, suggesting the existence of additional genes. Our recent genome-wide association study of short segment HSCR probands identified additional polymorphism for HSCR susceptibility, chiefly a non-coding allele in the type 3 semaphorin locus. Based on the previously confirmed effects of 4 newly-detected loss-of-function mutations in SEMA3C/D among HSCR patients, we plan to first explore their influence on axon outgrowth using in vitro cultured dorsal root ganglion cells and search for a dosage-dependent function, and secondly, examine how the mutants may affect the Semaphorin-Neuropilin-Plexin signaling activity and re-arrangement of the cytoskeleton. Lastly, we shall analyze whether (and how) wild-type and mutant Sema3 proteins could change/regulate the developmental features of the enteric neural crest cells. Our proposed study will disclose the biological and cellular mechanisms through which these classical axon guidance cues may participate in manipulating the development of the ENS, and their pathological roles in predisposing people to HSCR.

先天性巨结肠（HSCR）是引起功能性肠梗阻的最常见的小儿消化道畸形，属典型肠神经系统（ENS）发育异常性疾病。目前已经确定的11个易感基因仅能解释不足5%的患者的发病原因，高度提示其他致病基因的存在。申请人前期开展了针对短段型HSCR患者的全基因组关联分析研究，发现Semaphorin 3家族分子与该病的发生可能密切相关。本课题拟应用细胞共培养模型，以申请者在国际上首次发现的4个SEMA3C/D基因功能失活突变为切入点，首先研究突变蛋白对背根神经节神经元形态和轴突生长的影响作用及其剂量依赖效应，进而探索相应通路活性的效应分子和下游机制，以及受累细胞骨架的变化情况，最后分析共培养体系内Sema3蛋白功能异常对肠神经嵴细胞发育特性的影响作用。本项目希望通过以上研究进一步阐明轴突导向因子功能失调干扰胚胎期ENS发育、成熟的细胞和分子机制，为揭示HSCR的复杂发病机制提供新的线索和理论依据。

先天性巨结肠是引起功能性肠梗阻的最常见的小儿消化道畸形，属典型肠神经系统发育异常性疾病。本课题以背根神经节细胞（DRG）、neuro-2a细胞以及肠神经嵴细胞（ENCC）为实验材料，利用分别转染、表达野生型（WT）或突变型AP-SEMA3的HEK293T细胞聚集体与不同细胞共培养的方法，先后检测了先天性巨结肠患者携带的轴突导向因子编码基因突变对DRG突起生长、Sema3-Nrp-Plxn信号通路蛋白表达、neuro-2a细胞骨架以及ENCC细胞生物学的影响作用，结果发现，SEMA3D蛋白对共培养体系内神经细胞突起的生长无明显调节作用；而与对照组相比，虽然低浓度量（20ng/ml）的野生型SEMA3C对神经元突起生长也无明显作用，但当体系内融合蛋白的浓度增加至100ng/ml时，野生型SEMA3C可以明显促进体外培养DRG突起的生长，表现为分支增多、伸展距离增加以及突起密度增加，提示野生型SEMA3C对细胞突起的促进作用可能存在剂量依赖效应。与野生型相比，突变型SEMA3C V337M在极高剂量浓度（200ng/ml）条件下才可发挥一定的诱导生长作用，提示V337M虽然只改变了单一氨基酸序列，也可以明显干扰蛋白质的正常生理功能。 此外，0.5nm V337M突变型SEMA3C以及P615T突变型SEMA3D作用下的neuro-2a细胞的p-cofilin表达量较之野生型都明显降低，5个突变型蛋白均可造成不同程度的细胞轴突萎缩、断裂；最后，SEMA3C和SEMA3D对生长发育中的肠神经嵴细胞迁移都有一定的促进作用，尤以前者的作用较强；与野生型蛋白相比较，两个突变型SEMA3C蛋白（SEMA3C S329G、SEMA3C V337M）和一个突变型SEMA3D蛋白（SEMA3D P615T）虽然未改变ENCC的增殖水平、分化倾向和成熟速度，但可显著影响细胞迁移。上述研究结果为经典的轴突导向因子Semaphorin 3家族分子直接参与肠神经系统发育调控提供了有力的实验证据，相关细胞生物学特性的改变为今后开发针对性的治疗措施和干预手段拓展了新思路，开辟了新方向。