骨骼肌细胞衰老进程中INK4a通路与线粒体功能间动态相关性的研究

INK4a通路与线粒体是调控细胞衰老的两个中心环节， INK4a通路去阻遏和线粒体损伤都将导致细胞生长停顿并出现衰老表型。既往研究发现INK4a通路与线粒体之间存在种种联系，但两者间确切的依赖和制约机制尚未得出。本课题选取线粒体含量较高的骨骼肌细胞为对象：①检测INK4a通路阻遏（"失活"）和去阻遏（"失控"）时线粒体功能的动态变化，研究INK4a通路对线粒体功能的正向调控机制。其中，拟采用基因沉默技术特异性抑制p16ink4a表达，使通路阻遏；拟采用p16ink4a与hRb1双基因共导入技术（真核表达载体已在前期建立），使通路去阻遏。②分别以活性氧化剂过氧化氢及拮抗剂维生素E使线粒体损伤加速和延迟，观察两种情况下INK4a通路信号转导的动态变化，研究线粒体功能对INK4a通路的逆向调控机制。③对两者间具体作用方式进行探索。研究结果将为阐明两途径间关键生物大分子的相互作用关系提供重要证据。

目的：观察p16ink4a蛋白对骨骼肌卫星细胞衰老的诱导，并探寻其机制。.方法：采用机械法和胶原酶消化法，结合差速贴壁技术，分离培养人卫星细胞， desmin与myf-5抗体免疫荧光染色鉴定。构建慢病毒载体pLVX-p16ink4a，感染人骨骼肌卫星细胞，用Western blotting法测定蛋白水平；用β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老程度，JC-1染色及流式细胞仪观察线粒体膜电位变化，同时用Western blotting法检测转染后不同时间点bcl-2、bax、bak蛋白的表达变化。.结果：desmin与myf-5抗体免疫荧光染色鉴定结果表明获得了高纯度的骨骼肌卫星细胞。β-半乳糖苷酶染色可见转染组细胞蓝染显著多于对照组。JC-1染色及流式细胞仪结果表明p16ink4a蛋白使得卫星细胞线粒体膜电位降低，Western blotting法对转染后不同时间点卫星细胞bcl-2、bax、bak蛋白表达变化的检测结果表明：bcl-2表达呈现下降趋势，而bax、bak则表现出表达增加。.结论：p16ink4a蛋白可诱导骨骼肌卫星细胞衰老，主要分子机制可能是：1、使得定位于线粒体膜表面的凋亡抑制蛋白bcl-2表达下降；2、使促凋亡蛋白bax、bak表达上升；通过上述两个途径共同促使线粒体膜通道打开，膜电位降低，卫星细胞踏上衰老进程。