利用BN PAGE/SDS PAGE分离鉴定痢疾杆菌毒力相关膜蛋白复合物

痢疾杆菌的毒力与其膜上各种类型的分泌系统复合物密切相关，其中除III型分泌系统复合物的结构和功能研究较详细外，其它复合物的结构组成和功能都还只是推测。痢疾杆菌细胞膜上到底有多少毒力相关复合物？它们又是如何构成并有什么生物功能？本研究将从痢疾杆菌有毒株和毒力大质粒缺失株中提取保持天然结构的膜蛋白复合物，用BN PAGE凝胶电泳分离比较；然后切取差异条带以SDS PAGE电泳分离其组成亚基。质谱鉴定每个组成亚基，通过生物信息学分析初步建立这些毒力相关膜蛋白复合物的结构模型；表达纯化复合物各组成亚基并分析它们的相互作用，对结构模型进行初步的实验验证。最后构建组成亚基缺失突变体研究复合物在痢疾杆菌致病过程中的作用机理。在我们前期的工作中已建立本研究所涉及的相关技术，并且发现痢疾杆菌细胞膜上确有多个未知的蛋白复合物。该项目的开展将加深对痢疾杆菌的了解，为药物和疫苗研究找到新的靶标。

用BN PAGE凝胶分离比较了三株福氏志贺氏菌野生株2457T、M90T和301与各自的大质粒缺失株的膜蛋白复合物，在M90T中发现一个野生株特有的复合物条带，分子量约为290KDa，暂命名为T-290。经第二向SDS PAGE分离复合物亚基和MALDI-TOF质谱分析，T-290由一个毒力蛋白apyrase和5个染色体编码的蛋白（ClpB、DnaK、YdgA、EF-Tu、GapA）组成；其中apyrase和分子伴侣DnaK都是已知毒力蛋白IcsA的极性定位和actin聚集所必需。蛋白相互作用分析表明这6个蛋白之间以及与IcsA之间存在广泛的直接相互作用，并根据相互作用关系描绘了复合物结构模型；将这些蛋白表达纯化进行体外复合物重建然后BN PAGE分离分析，能够得到相应的复合物。通过构建这些蛋白的缺失突变体并感染HeLa细胞免疫荧光观察actin的聚集，发现除了已知的apyrase和DnaK之外，YdgA也是actin聚集所必需的；这些结果表明，膜蛋白复合物T-290通过调控IcsA的极性定位，引起actin聚集，促进细菌横向移动进入其它宿主细胞。复合物体外重建实验表明5个染色体编码蛋白预先形成一个亚复合物，然后被apyrase招募形成完整的毒力蛋白复合物。.通过该项目研究，我们发现了一个新的毒力相关膜蛋白复合物，确定了其功能，并发现该复合物由毒力蛋白和染色体编码蛋白共同组成，这对了解毒力大质粒和染色体的相互调控以及致病菌的毒力进化机制有一定的指导意义。综合全部结果准备发表于国际期刊的英文论文正在审稿，尚未见刊；基于阶段性结果发表了5篇中文论文。