一种新型肽核酸反向杂交技术在检测HBV耐药突变的应用研究

利用反向杂交技术实现对血清样本中常见HBV耐药突变株的特异性检测，对于迅速和精确地监测HBV药物抗性并将更快和更有效地设计抗HBV治疗策略具有非常重要的意义，但目前基于核酸的反向杂交技术在灵敏度，特异性和稳定性方面仍具有不足，限制了该方法的大量运用。本研究利用肽核酸杂交的优势，发展一种新型的肽核酸反向杂交技术，通过比较基于膜介质的肽核酸和核酸杂交在信号强度和特异性方面的差异，阐明肽核酸杂交的优势；进一步通过杂交条件的优化筛选出检测HBV常见耐药突变位点的特异性肽核酸探针，并通过两种评价体系（含有LAM，ADV和ETV耐药突变的标准耐药质粒株和临床样本）来评价这种新型检测技术的灵敏度，特异性和稳定性。本项目的实施和完成可为研制一种快速，简便，直观，灵敏，特异的检测HBV耐药突变的新型试剂盒奠定基础，同时该方法技术的应用对临床的合理用药、个体化治疗、预后的评估具有重要的意义。

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，感染呈世界范围广泛流行。除干扰素外，拉米夫定，阿德福韦酯和恩替卡韦是目前被批准治疗慢性乙型肝炎的三种核苷类似物药物，这几种药物可以在单一治疗或在联合治疗中使用，可有效降低病毒载量、显著阻断慢性乙型肝炎患者发展为肝硬化和肝细胞癌等，但由于HBV耐药突变株的出现，效果常常不能持久。本项目主要针对核苷酸药物长期治疗引起的耐药问题，从多个角度开展研究：.（1）大规模临床样本标本库的建立 . 按照项目统一标准从临床附属第一医院，附属第二医院等友好合作医院感染科收集的具备完整临床资料、实验研究资料，以及慢性乙型肝炎患者和肝癌患者的血清样本和肝脏样本的病种标本库和数据库，采用上海万格冻存管理系统进行规范管理。.（2）肽核酸检测HBV常见耐药位点的方法研究. 首先通过生物信息学方法建立起国内HBV常见的耐药图谱，结合肽核酸在杂交中的优势和反向杂交技术的特点，通过杂交条件的优化建立起肽核酸反向杂交技术，实现对HBV常用核苷类似物耐药相关突变毒株的检测，最后通过构建的标准耐药质粒株和临床样本进行对检测指标（灵敏度，特异性和稳定性）进行评价，表明肽核酸反向杂交技术的灵敏度可达到98.61％，准确性为97.88%。 .（3）HBV RNAseH 抑制剂的筛选. 建立起抑制HBV RNAseH体外biochemical和cell culture药敏体系，从21种HIV RNAseH和HIV Integrase的抑制剂中筛选出能够抑制HBV RNAseH的小分子化合物，并对其抑制机制进行了研究。. 本项目的完成不仅建立起快速，简便，特异的检测HBV 阿德福韦耐药位点的特异性肽核酸反向杂交技术，而且筛选出抑制乙肝病毒复制的新化合物，其研究结果不仅有助于临床病毒耐药株的检测，而且为新的抗病毒疗法提供了新靶点和新思路。. 项目在执行期间一共发表文章6篇，其中SCI 4篇，中文核心期刊2篇，培养博士研究生1名，硕士研究生2名，课题负责人在美国圣路易斯大学医学院交流学习1年，并邀请美国专家John Tavis教授进行交流访问。课题负责人参加国际会议，国内会议各2次，研究结果分别在美国病毒学会会议上做报告1次，在国际HBV 分子病毒学会议进行墙报交流1次。