长链非编码RNA H19在颞叶癫痫海马神经元凋亡中的作用及调控机制

Epilepsy is a common chronic disease of the nervous system threating to human health seriouslly, of which the etiology is complex and not very clear. In previous work, we screened the lncRNA expression profile of the hippocampus of the temporal lobe epilepsy (TLE), and validated through PCR. The most up-regulated lncRNA in hippucampal tissues was H19 with more than 8 fold, which prompted the strong correlation between H19 and apoptosis. In view of the role that cell apoptosis played in epilepsy, these observations led to our hypothesis that,H19 may play an important role in the development of epilepsy. In our current project, we intend to carry out in vivo and in vitro experiments,through the methods of constructing interference lentiviral vectors, RIP-seq, RNA Pull-down, PCR, immunohistochemistry and western blot, to investigate the lncRNA function and mechanism of action from the levels of the molecular, the cellular and the integral. So as to clarify the function and the regulatory mechanism, by which H19 played in the apoptosis in hippocampal neurons of the TLE, which is to provide the theoretical basis for the mechanism and the therapeutic targets of epilepsy.

癫痫是常见的严重威胁人类健康的神经系统慢性疾病，其病因复杂且不明确。前期工作中，我们对颞叶癫痫大鼠海马组织长链非编码RNA（lncRNA）表达谱进行了筛查、生物信息学分析及PCR验证，发现癫痫大鼠海马组织lncRNA发生显著性差异改变，其中lncRNA H19上调达8倍以上，而且提示H19与凋亡具有强相关性。鉴于细胞凋亡在癫痫中的作用，我们推测lncRNA H19在颞叶癫痫所致的海马神经元凋亡中有重要的调控作用。本课题中，申请者拟分别从在体、离体层面，通过构建干扰慢病毒载体、细胞转染、RIP-seq、Pull-down、PCR、免疫组化及Western-Blot等方法从分子、细胞及整体水平系统深入地研究H19的功能及作用方式，阐明H19在颞叶癫痫海马神经元凋亡中的作用及调控机制，为研究癫痫发病机制提供理论基础，并为颞叶癫痫疾病提供新的治疗靶点。

颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人中最常见的癫痫综合征，多为药物难治性癫痫，临床表现为反复自发性癫痫发作、记忆功能障碍以及海马硬化等。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA） H19是一段长2.3 kb的高度保守的lncRNA，其具体生物学功能因疾病状态以及组织学类型而异。本课题基于前期研究基础，通过建立颞叶癫痫动物模型，采用qPCR、腺相关病毒转染、基因芯片、蛋白免疫印迹、荧光素酶报告基因、组化与免疫组化、脑电行为学监测及水迷宫等方法，系统阐述了H19在癫痫发生过程中的生物学作用及机制。本课题有以下发现：1. H19于大鼠癫痫发生的静止期表达升高，而于急性期和慢性期表达降低，于人TLE患者海马组织表达降低；2. 基因芯片筛选及生物信息学分析提示H19涉及的生物学功能包括髓鞘形成、MAPK通路激活、免疫与炎症反应和细胞凋亡等；3. H19过表达加重癫痫大鼠癫痫发作、记忆功能障碍、海马神经元损伤及细胞凋亡，而H19干扰可改善上述变化。H19可作为CeRNA竞争性抑制微小RNA let-7b，进而调控凋亡蛋白Casp3的表达；4. H19过表达促进癫痫大鼠海马组织星形胶质细胞和小胶质细胞活化增生、炎症因子释放，并促进JAK/STAT通路激活，而H19干扰可逆转上述改变。而阻断JAK/STAT通路可抑制癫痫大鼠海马组织星形胶质细胞和小胶质细胞活化增生、炎症因子释放。以上结果表明：1. H19在颞叶癫痫发生发展的不同时期具有不同的表达趋势，在急性期和慢性期表达降低，而在潜伏期则表达显著升高；2. 癫痫发生过程中，H19的差异表达可影响大量基因的表达，这些基因涉及到多个与癫痫发生相关的生物学功能和信号通路；3. H19可通过内源竞争性RNA机制结合let-7b促进癫痫发生过程中海马神经元缺失与凋亡；4. H19可通过激活JAK/STAT通路促进癫痫发生过程中海马组织星形胶质细胞和小胶质细胞活化与增生。本研究为阐明颞叶癫痫的发病机制提供了理论基础，并有望为将来颞叶癫痫的治疗提供了新的干预靶点。