PEPC基因在石斛属植物C3/CAM转换中的作用机理及其分子进化研究

C3/CAM转换的碳同化代谢是植物响应水分亏缺、提高光合利用率的生理调节和遗传进化。石斛属(Dendrobium)居兰科第二大属，其中很多种为世界名贵花卉和传统名贵中药材。在前期对多种石斛种质收集评价、光合特性和营养生理研究基础上，拟选取观赏和药用价值高、形态和生境不同的30多个石斛属植物进行碳同化类型鉴定、PEPC/Rubisco酶活性测定以及Pepc基因基因克隆和序列分析；通过基因的同源异构体、基因结构与组成、核苷酸和氨基酸遗传进化距离等比较分析，探讨Pepc基因在C3/CAM转换中的作用机理和分子进化。这不仅能填补石斛属植物碳同化代谢分子机理研究的空白点，丰富兼性CAM植物应对干旱胁迫、高效固碳的理论；而且在面对全球气候变暖，干旱、半干旱地区日益增多的背景下，对于高效固碳、节水节能以及提高园艺生产力和提升花卉产业水平具有重要的实践意义和生态意义。

石斛属（Dendrobium）是兰科三大属之一，具有较高的观赏价值和药用价值。研究表明石斛属存在专性CAM类和C3/CAM中间型植物，但未见专性C3类植物的报道。CAM途径起源于C3光合途径，但起源的分子进化机制不清楚。PEPC酶是CAM途径中最关键的酶之一，因此，研究PEPC的分子进化成为研究CAM进化的突破口。本研究选取部分石斛属植物为材料研究其光合碳同化途径；通过CAM途径关键酶PEPC基因的克隆和鉴定、序列结构和进化的分析以及不同PEPC异构体的表达等，探讨PEPC基因在石斛属植物中的分子进化。主要结果如下：通过叶片形态和叶片厚度调查以及叶片同位素δ13C的比值、可滴定酸含量以及CO2气体交换等生理生化特征比较，发现石斛属植物中存在不仅专性CAM及C3/CAM中间型植物，也存在专性C3植物。扫描电镜观测到在充分供水和干旱胁迫后，金钗石斛、鼓槌石斛和春石斛‘V4’的气孔开闭状态发生改变，即从中午开放，夜间关闭转变为中午关闭，夜间开放；美花石斛表现为两种状态下都是中午气孔关闭，夜间开放；流苏石斛刚好相反。充分供水和干旱胁迫后的专性C3类石斛的苹果酸和碳水化合物含量早晚差值无显著变化，其专性CAM及C3/CAM中间型石斛发生显著变化，而几种石斛柠檬酸含量很低，早晚差值不显著，表明苹果酸在石斛属植物C3/CAM转变中起作用。克隆并分析了PEPC基因序列及一致性，表明石斛属植物含有两类CAM型和一类C3型PEPC基因，进一步系统进化树重建表明PpcA属于具有光合作用的CAM型PEPC基因，而PpcC是“看家型”基因，但不能确定PpcB 类基因的功能类型。并推测石斛属植物PEPC基因的进化起源模式。以美花石斛PpcA、PpcB和PpcC三类PEPC基因的蛋白质序列为例，利用生物信息学方法分析发现三类PEPC蛋白都属于植物型PEPC家族， PpcC属于“看家型”基因，PpcA属于CAM型，而而PpcB也可能属于另一类“看家型”基因（即“根型”）。生物信息学分析表明石斛属植物的三类PEPC蛋白均含有不同的低复杂区域。以上研究结果为研究C3/CAM代谢转换提供了模式植物类型，填补了石斛属植物碳同化代谢分子机理研究的空白点，丰富了兼性CAM植物应对干旱胁迫、高效固碳的理论。