除虫菊CDS基因功能鉴定及其双重调控除虫菊酯前体代谢机制解析

Pyrethrum (Chrysanthemum cinerariifolium,syn. Tanacetum cinerariifolium) is ornamental plant of Composite family,and is well-known as a safe and non-toxic natural pesticide of pyrethrins, the supply has not been adequate to the demand.However, the internal mechanism of pyrethrin biosynthasis pathway is unclear to date. Recently, chrysanthemyl diphosphate synthase (CDS) was reported to be the first key synthase to catalyse the precusor dimethylallyl diphosphate (DMAPP) into chrysanthemyl diphosphate (CPP). Interestedly, we found that the transgenic CDS chrysanthemum plant produced chrysanthmol (COH)and expressed in the leaves glandular tricomes;Furthermore,the pyrethrin content,which was reprorted to be related to tricomes,has not been detected in pyrethrum tricomes in our experiments.Thus, this study is conducted to determine the CDS gene function by observing the glandular tricomes,secretion structures and cellular localization of pyrethrin in transgenic pyrethrum plants,and cell lysate reaction is proposed to investigate the bifunctional enzymes of CDS and the relationship with pyrethrin biosynthesis, storage and transportation. The study would provide informative theoretical basis and practical foundation for molecular modified breeding in pyrethrum and chrysanthemum by revealing the pyrethrin metabolism.

除虫菊为菊科观赏植物，以产生安全无毒、环境友好的天然杀虫剂除虫菊酯而著称，其天然产品供不应求。目前其除虫菊酯代谢路径的机制尚不清楚。菊基二磷酸合成酶（CDS）是新近发现催化其前体二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）产生菊基二磷酸（CPP）的关键基因，有趣的是我们以除虫菊CDS基因转化高感蚜虫的菊花时腺体中却检测到CPP的下游产物菊基醇（COH）；而且，前人认为除虫菊酯含量与腺体密度相关，但我们检测腺体中却没有除虫菊酯。本项目拟在前期除虫菊（与菊花）腺体观测、遗传转化体系建立基础上，通过不同器官和发育阶段腺体与分泌管观测、内含物测定及其除虫菊酯细胞定位、CDS基因和启动子转化除虫菊、蛋白体外表达和细胞溶解反应等，探究腺体与CDS产物表达以及除虫菊酯合成、贮运的空间关联，解析CDS功能及其双重调控除虫菊酯前体的机理。本研究对揭示整个除虫菊酯代谢机制、提高除虫菊酯含量和菊花抗虫性具有重要的理论意义。

除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）为菊科多年生草本植物，兼具观赏植物和经济多重用途。 本研究我们从除虫菊克隆得到TciCDS基因，纠正了其编码区前8个氨基酸的起始位点，其余部分与TciCDS基因一致，我们将其重新命名为TciCHS基因.主要研究结果如下：.1 首次揭示了菊花转除虫菊TciCHS产生菊基醇的双重防蚜机制。TciCHS转基因菊花植株能明显降低蚜虫的繁殖率并影响蚜虫的刺吸行为。开放条件下的蚜虫自然感染实验也证实转基因植株具有很强的抗蚜性。.2.克隆并验证除虫菊TciCHS腺体特异性启动子。从除虫菊腺体克隆到1128 bp的TciCHS启动子片段，其序列包含一系列与激素、光信号和生物与非生物胁迫相关的顺式元件。将TciCHS启动子连接报告基因GFP转化菊花， GFP仅在菊花叶片和茎段的腺体组织表达，表明除虫菊TciCHS启动子属于腺体特异性启动子。并通过启动子缺失片段瞬时转化烟草，研究了启动子核心的活性区域。 .3.克隆得到CHS-like基因和FDS-like基因。CHS-like基因同样定位于质体，其在植物体外及体内能优先催化DMAPP和IPP产生法尼醇FOH，同时也能水解不同的异戊烯基二磷酸（GPP、FPP、CPP）生成相应的萜类。因此，我们将其命名为FAS基因，该基因具有异戊烯基转移酶和萜类合成酶的双重活性。. 4. 体内外TciCHS蛋白活性。实验表明，TciCHS蛋白在植物体外催化活性很低，而在大肠杆菌菌体以及菊花与烟草体内具有较高的催化活性。我们克隆了烟草NiGGDS基因以及除虫菊TciGGDS基因。GGDS蛋白能与TciCHS蛋白互作形成异质二聚体形态从而提高TciCHS的催化活性。.发表sci 文章3篇。其中1篇发表在Plant Biotechnology Journal (IF 7.443).另1篇正提交中。