chd1l在精原干细胞自我更新和分化中的作用及分子机制

精原干细胞是存在于睾丸内的成体生殖干细胞，经胚胎干细胞（ESCs）体外培养体系诱导即可转变为ESCs样细胞，是除ESCs及诱导性干细胞之外的又一多潜能干细胞源，在生殖及再生医学领域有广阔的应用前景，但其自我更新及分化机制尚待阐明。CHD1L是我们在肝癌内首次分离并克隆的癌基因，研究表明其具有染色质解旋及DNA修复功能。我们前期研究发现生理状态下CHD1L表达于骨髓及睾丸，分别定位于造血干细胞和精原干细胞，提示CHD1L的表达可能与干细胞生物学功能有关。本研究拟分离、构建多能性标记Oct4启动子调控的绿色荧光蛋白转基因小鼠精原干细胞 (Oct4/EGFP+ SSCs)模型；用携带CHD1L RNAi片断的慢病毒载体系统敲减CHD1L表达，经体内外实验探讨其对SSCs自我更新及分化的作用；运用全基因表达谱及microRNA芯片技术，分别从转录水平及转录后水平深层次解析CHD1L的分子机制。

精原干细胞起源于早期胚胎时期的原始生殖细胞，是存在于雄性睾丸内的唯一能将遗传物质传递给子代的成体生殖干细胞，近年来发现精原干细胞有很强的的可塑性，能在体外诱导为胚胎干细胞样的多能干细胞，但目前对其自我更新及分化机制的研究却知之甚少。CHD1L 是我们在肝癌内首次分离并克隆的癌基因，在肝癌中特异性高表达，在肿瘤研究中我们发现，CHD1L具有染色体重塑的功能，而大多数染色体重塑因子与基因的转录、组蛋白的修饰、细胞周期及DNA损伤修复等多种细胞的生物学功能相关。近来，有研究报导CHD1L在PARP1介导的干细胞早期重编程及多能性的调控中扮演着至关重要的角色，我们发现生理状态下CHD1L高表达于小鼠骨髓和睾丸等具有成体干细胞的组织中。通过一系列的实验我们证实并明确了CHD1L在睾丸中的时空表达及其在调控精原干细胞自我更新中所起的重要作用。.本研究的主要内容有以下几个方面：.1．Oct4/EGFP转基因小鼠精原干细胞（SSCs）分离、培养及鉴定。.精原干细胞的分离培养是本研究的关键部分。通过免疫磁珠分选的方法分离纯化精原干细胞（mSSCs），并对分离所得细胞进行干性分子鉴定。课题组使用Accutase酶代替传统的两步法消化中所使用的胰酶来改良并优化分离、纯化精原干细胞的方法，成功建立小鼠精原干细胞体外分离、纯化方法；另外，对精原干细胞的培养方法也做了一定的改进，建立了稳定培养数代具有干性并可用于下游实验的精原干细胞，并进一步证实CHD1L与精原干细胞标记蛋白OCT4，PLZF,GFRA1共表达。.2.不同发育时期Oct4/EGFP转基因小鼠睾丸组织中CHD1L表达定位及阳性细胞类别鉴定。.取出生后5d,6d,7d,2w,3w,4w,5w,6w,7w,8w雄性小鼠睾丸组织，制作石蜡切片，HE染色观察小鼠睾丸曲精小管的结构变化，通过生殖干细胞特异性标记分子plzf、OCT-4、GFRa1等免疫荧光双标确定CHD1L表达于新生小鼠睾丸组织中的精原干细胞。.3．构建携带Chd1l siRNA 片断的慢病毒载体系统，探讨敲减Chd1l表达对SSCs自我更新及分化的影响及其分子机制。利用mRNA和microRNA测序技术，建立Chd1l敲减后差异表达RNAs数据库，筛选出并确证了Chd1l-miRNA486-5p-MMP2信号通路调控精原干细胞自我更新的作用。