绒山羊次级毛囊发生发育相关基因筛选与作用机制研究

Based on the research achievements in recent years about morphogenesis and development of hair follicle in the Inner Mongolia Cashmere goat (Capra hircus) embryo stage, and with the goat production demand, we take Inner Mongolia Cashmere goat as the research object which is unique genetic resources of CHINA, launch the research about related gene’s molecular regulation mechanism of secondary hair follicle morphogenesis, growth and development in embryo stage, and lay a theoretical foundation for speeding up the progress of genetic breeding of cashmere goats. In this study, we continue the research on the basement of the finished achievement about skin hair follicle transcriptome and proteome sequencing of 45 days, 55 days and 65 days embryo, and work on the analysis of the transcriptome data associate with proteome data, from the data analyze we find the important genes which is related secondary follicle morphogenesis and development as candidate genes. Using the method of real-time PCR and in situ hybridization to detect the candidate genes expression patterns in different development period of the secondary hair follicle and further confirm the candidate genes which is truly related with development of secondary hair follicle . Using the method of western blot to detect the proteins expression level of the candidate gene. By construct the candidate genes overexpression vector, and transfect it into cultured cashmere goat dermal fibroblasts cell and dermal papilla cells in vitro, to explore the candidate gene work effection relationship in the signaling pathways of the occurrence and development of secondary hair follicle . In summary, this project will reveal the regulatory mechanism of the candidate genes in morphogenesis and development of secondary follicle in cashmere goat .

基于课题组近年在内蒙古绒山羊胚胎期毛囊形态发生、发育规律研究方面取得的成果，结合绒山羊生产需求，以我国特有遗传资源内蒙古绒山羊为研究对象，开展胚胎期次级毛囊形态发生、生长发育相关基因分子的调控机理研究，为加快绒山羊遗传育种进展奠定理论基础。本研究在课题组完成绒山羊胚胎期45天、55天、65天皮肤毛囊转录组和蛋白质组测序的基础上，开展转录组数据和蛋白质组数据的联合信息分析，发掘出次级毛囊发生、发育重要的相关基因作为候选基因；运用实时定量PCR、原位杂交技术检测候选基因在次级毛囊不同发育时期的表达模式，进一步确认次级毛囊发生发育相关候选基因；通过Western Blot技术检测候选基因蛋白水平的表达模式；构建候选基因过达载体，转染体外培养的绒山羊真皮成纤维细胞、毛乳头细胞，探索候选基因在次级毛囊发生、发育相关信号通路基因间的作用关系。揭示候选基因在绒山羊次级毛囊形态发生、生长发育中的作用机制。

根据前期研究结果本研究对45天、55天和65天的绒山羊胎儿体侧皮肤进行了转录组和蛋白组测序，对两组学数据联合分析发掘与绒山羊胚胎期毛囊发生发育相关基因并利用生物技术手段开展候选基因的功能验证，为毛囊发生、发育分子调控机理提供研究基础。主要研究结果如下：.（1）转录组测序数据分析发现3个时期差异表达基因4581个，3个时期有204个共同表达的差异基因。其中E55 vs.E45有1590个差异表达基因，E65 vs.E55有2442个差异表达基因，E65 vs.E45有3844个差异表达基因，.（2）GO功能分析发现差异基因显著富集在细胞成分，分子功能和生物过程方面；KEGG pathway分析发现，部分差异基因注释在WNT、TGFβ和ECM受体相互作用通路中。.（3）分析了3个时期9个样品的可变剪切类型，包括A5SS，A3SS，ES和IR，其中最普遍的剪切事件为IR。.（4）通过ITRAQ鉴定到3个时期胎儿皮肤有差异蛋白质378个，其中E55 vs.E45有143个差异蛋白质，E65 vs.E55有176个差异蛋白，E65 vs.E45有201个差异蛋白。.（5）GO富集分析发现，差异蛋白在属于细胞过程、代谢过程和生物学调节等的生物学过程中富集；KEGG分析发现部分差异蛋白质注释到ECMR interaction，Focal adhesion，PI3K-Akt，MAPK，TGF-beta，VEGF、WNT和p53等信号通路中。.（6）转录组和蛋白组数据联合分析发现后两个时期共同差异上调基因238个，下调表达基因920个，部分基因的RNA-seq和ITRAQ测序数据在3个胎儿时期中的变化趋势一致。.（7）利用实时定量PCR检测了FoxN1、FoxE1、FoxI3、DCN、EDA和EDAR基因在毛囊发生发育过程中的表达变化情况，大部分基因在45天，55天和65天时表现持续上调趋势。.（8）利用Western blot技术检测了FoxN1、FoxE1、DCN和EDAR的蛋白水平表达在45天，55天和65天时表现持续上调趋势。.（9）利用免疫组化技术检测了EDA、EDAR基因在皮肤毛囊中的表达位置，结果显示主要表达于皮肤上皮细胞。.（10）利用过表达、RNA干扰技术，在细胞水平上探索了DCN过表达、EDA、EDAR基因干扰影响了其他相关基因的表达。